Günümüzde immünohistokimya, spesifik moleküler belirteçlerin varlığını ve patoloji durumundaki değişikliklerini belirlemek için artan sıklıkta kullanılmakta ve kantitatif analiz yapma olasılığına kök katmaktadır. İmmünohistokimya, özellikle immünoreskence tekniği, larva ve yetişkin zebra balığı hayvan modelinde kullanılır, ancak zebra balığı için iyi bir standart immünohistokimya protokolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, yetişkin zebra balıklarında önemli proteinlerin evrimsel olarak korunmasını incelemek için kullanılabilecek bir protokolü tanımlıyor ve gösteriyoruz.
Yetişkin zebra balıklarında immünohistokimya için iyi bir protokol, bu hayvan modelinin morfolojik ekspresyonunu ve yüksek oranda korunmuş biyomoleküllerin dağılımını incelemek için yararlılığının altını ortaya konmaya yardımcı olabilir. Bu yöntem aynı zamanda insan fizyopatolojisi ile ilişkili patolojik koşullar nedeniyle bu biyomoleküllerin olası değişikliklerinin analiz ine yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren Dr.Lea Tunisi, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.
Bu işlem başlamak için, eksi 20 santigrat derece bir kriyostat için hazırlanan dondurulmuş doku blokları aktarın. 10 mikrometre koronal veya sagital kesitblok kesin. Daha sonra, immünohistokimya için uygun yapışkan cam slaytlar üzerine alternatif seri bölümlerde dokuları toplamak ve devam etmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derece saklayın.
İlk olarak, slayt üzerindeki doku alanını ayırmak için solvente dayanıklı bir kalem kullanın. 0.1-molar fosfat tamponkullanarak beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın. Daha sonra, 0.3 mililitre Triton X-100'ü 100 mililitre00 mililitre0 0,1-molar fosfat tamponunda çözün erek Triton X-100 0.3%0.3 normal eşek serumunu fosfat tamponunda %0.3 triton X-100 içeren normal eşek serumunu hazırlayın ve bloke çözeltisini hazırlayın.
Hücre zarını permeabilize etmek ve spesifik olmayan bağlama alanlarını engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca permeabilizasyon tamponu PB-Triton X-100%0.3 çözünmüş normal eşek serumçözeltisi ile bölümleri kuluçkaya yatırın. İlk olarak, 0.1-molar fosfat tampon ile beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın. PB-T seyreltilmiş birincil antikorların karışımını ekleyin ve oda sıcaklığında nemli bir kutuda bir gecede bölümleri kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, 0.1-molar fosfat tampon ile beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın. PB-T seyreltilmiş ikincil antikorların uygun bir karışımında iki saat oda sıcaklığında kuluçka bölümleri. Başlamak için, 0.1-molar fosfat tampon ile beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın.
Nükleer boya DAPI hazırlamak için fosfat tampon üç mililitre DAPI 1.5 mikrolitre çözünür. Boyadaki bölümleri ters lekesi. Daha sonra, uzun süreli kullanım için doku ve leke stabilize etmek için slaytlar coverslip montaj ortamı kullanın.
Floresan numuneler karanlıkta dört santigrat derecede saklanabilir. İmmünofloresan protokolünü tekrarlayın ve primer veya sekonder antikorları atlayın veya negatif kontrolü hazırlamak için primer veya sekonder antiserumu fosfat tamponuyla değiştirin. Daha sonra, immünoresans protokolünü tekrarlayın ve her primer antikora göreli peptid fazlalığı yla önceden emdirin.
Pozitif kontrolü hazırlamak için fare beyninin dilimleri üzerinde immünofloresan protokolünü tekrarlayın. X-Y-Z motorize sahne, dijital kamera ve satın alma ve analiz yazılımı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, gözlemlemek ve immünolekeli bölümleri analiz. 5x, 20x ve 40x hedefleri ile dijital görüntüler edinin.
Düşük büyütme montajı oluşturmak için kullanılabilir kanalların her birinde düşük büyütme de her bölümün görüntüleri alın. Floresan görüntülerini maksimum kontrast ve kaplamaya normalleştirin. İlgi alanı boyunca, 1 ila 1,8 mikrometre odak adımları ile altı odak düzlemleri aracılığıyla görüntü seri Z-yığınları toplamak.
Her kanal için bu koleksiyonu ayrı ayrı gerçekleştirin. Bundan sonra, 10 yineleme uygulaması yla görüntüleri deconvolve görüntüleme deconvolution yazılımı kullanın ve tek bir maksimum projeksiyon görüntü içine seri Z-düzlem görüntüleri daraltmak. Işık ve kontrast için mikrografları ayarlamak için uygun bir görüntü düzenleme yazılımı kullanın.
Erişkin zebra balıklarının bağırsaklarındaki OX-A ve OX-2R dağılımının immünohistokimyasal analizi, OX-A ve OX-2R'nin farklı lokalizasyon bölgelerini ve DIO zebra balığının bağırsak hücrelerinde ifade artışlarını göstermektedir. MEDIAL ve ön bağırsak hücrelerinde OX-A için yoğun bir kahverengi boyama gözlenir. OX-A'nın immünekspresyonu farklı bağırsak bölmelerinde net sinyaller verir ve anteriordan medial bağırsağa doğru azalır.
Benzer sonuçlar DIO ve kontrol diyet zebra balığı bağırsakOX-2R immünekspresyon için gözlenmektedir. DIO yetişkin zebra balığında artmış OX-A sinyaline diğer bağırsak kompartmanlarında OX-2R aşırı ekspresyonu eşlik eder. İmmünofloresan görüntülerin doğru analizi, DIO yetişkin zebra balığının bağırsaklarında kontrol diyeti zebra balığına göre OX-2R/CB1R kolokalizasyonunun arttığını göstermektedir.
Benzer bir durum dorsal telensefalon, hipotalamus, optik tectum, torus lateralis ve inferior lob diffüz çekirdeği gibi farklı beyin bölgelerinde gözlenmektedir. Oreksin-A ve CB1R kolokalizasyonu ile çift immünostaining ile hipotalamus oreksinerjik nöronlarda kolokalizasyon artışı olduğu, oreksin-A floresan sinyalinin artması ile birlikte gözlenmiştir. Bu sonuçlar, çift immünfloresansın fizyolojik olarak korunmuş protein ekspresyonunu, hedef proteinlerin kolokalizasyonunu ve farklı patolojik koşullarda dağılım ve/veya ekspresyon değişikliklerini belirlemeye nasıl yardımcı olabileceğini göstermektedir.
İmmünofloresans kullanarak, biyomoleküllerin birlikte dağılımını ve ortak ekspresyonunu, olası etkileşimlerini daha iyi anlayabiliriz ve farklı patolojiler durumunda onların değişimlerinin görünür bir görüntüsünü de görebiliriz. Ayrıca, metabolik enzim ekspresyonu veya reseptörlerinin nöroanatomik dağılımı dokular içinde protein sinyalizasyon rolünü daha da ortaya çıkarabilir. Mevcut teknik çalışma, yetişkin bir zebra balığı modeli kullanarak, iki yüksek korunmuş sistem, oreksin ve endocannabinoidler çalışma immünororesans yaklaşım tanıttı.
Burada ilk kez yetişkin zebra balığının beyninde açıklanan bu protokolü kullanarak oreksin-2 reseptörlerinin anatomik dağılımı ve koekspresyonu ve endofanabinoid-CB1 reseptörleri belirlenmemiştir. Burada immünohistokimya deneyleri için açıklanan protokolleri ve yetişkin zebra balıklarındaki peptidlerde bulunan reseptörlerin mekansal dağılımını ve organizasyonunu tespit etmek ve işlevlerini daha iyi anlamak için öneriyoruz.
