La microscopie DIC est supérieure au champ sombre lors de l’imagerie des nanoparticules plasmoniques dans des environnements complexes. Toutefois, DIC exige également plus de connaissances et de compétences pour obtenir des résultats reproductibles. La microscopie DIC fournit à la fois une résolution latérale élevée et une faible profondeur de champ.
Ces deux caractères sont extrêmement importants lors de la surveillance des nanoparticules dans les cellules ou dans des environnements complexes. Pour commencer, utilisez un stylo à inscription pour placer une marque de rayures peu profonde et courte sur le centre de chaque couvercle en verre, puis nettoyez le verre tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, utilisez une micropipette pour enlever 100 microlitres d’une solution nanoparticule d’or de 05 milligrammes par millilitre de son récipient de stockage d’origine, et éjecter la solution dans un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à 6000 fois la gravité. Une fois terminé, retirer le supernatant avec une micropipette pour se débarrasser de l’excès de surfactant de la solution nanoparticule. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’eau ultra-pure au tube de centrifugeuse.
Vortex brièvement l’échantillon pour briser la pastille, puis soniquer pendant 20 minutes immédiatement après pour résusquer complètement les agrégats de nanoparticules. À l’aide d’une micropipette, dropcast six microlitres de solution nanoparticule sur le coverslip en verre nettoyé et rayé. Ensuite, retournez soigneusement le coverslip et placez-le sur un deuxième plus grand morceau de verre microscope.
La goutte doit rapidement s’étaler uniformément entre les deux morceaux de verre. Prenez soin d’éviter d’avoir des bulles d’air coincées entre les deux morceaux de verre. Utilisez une ligne étroite de vernis à ongles pour sceller les bords du coverslip pour empêcher l’évaporation du liquide.
Placez l’échantillon au stade du microscope et alignez l’objectif et le condenseur du microscope. Ajustez la mise au point pour trouver le plan focal avec l’échantillon dessus et localisez la marque de rayures créée plus tôt. Concentrez-vous dessus et peaufinez la mise au point jusqu’à ce que les nanoparticules entrent en vue.
Pour déterminer le placement précis du condenseur, utilisez la méthode d’éclairage Kohler en commençant par l’objectif 20x, puis en passant à des grossissements élevés tels que 80 ou 100x. Ensuite, sélectionnez une région d’intérêt dans l’échantillon pour l’imagerie. Centrez la région dans le champ de vision de la caméra et ajustez la mise au point au besoin.
Si le microscope a la conception de Senarmont, commencez par le polariseur placé près de l’extinction maximale de fond et tournez graduellement le polariseur vers l’extinction décroissante de fond. L’intensité de fond augmentera graduellement. Le réglage idéal est atteint lorsque les nanoparticules atteignent leur plus grande différence d’intensité par rapport à la moyenne locale de fond.
Pour les nanoparticules plasmoniques, le plus grand contraste est généralement atteint avec un fond relativement sombre à ou près de l’extinction maximale du fond. Éteignez l’éclairage de la pièce pour empêcher l’éclairage parasite d’interagir avec le processus. Mettre en place un filtre à bande-pass de 10 nanomètres pleine largeur avec sa longueur d’onde centrale co-localisée avec la longueur d’onde principale localisée de résonance de plasmon de surface afin de visualiser la région d’intérêt.
Ensuite, ajustez l’intensité de la lampe ou le temps d’exposition jusqu’à ce que le niveau de fond soit de 5 % à 40 % du niveau de capacité maximale de la caméra. Aucun objet de la région d’intérêt ne doit présenter d’intensités de signal qui dépassent 90 % du niveau d’intensité maximale de la caméra. Imagez l’échantillon avec une série de filtres à bande qui ont chacun une largeur totale à un demi-maximum de 10 nanomètres, et qui, dans l’ensemble, permettent l’imagerie sur l’ensemble de la plage d’intérêt de longueur d’onde.
Assurez-vous que l’intensité de fond dans les images reste à moins de 5 % l’une de l’autre en ajustant le temps d’exposition et non la puissance de la lampe. Après avoir changé de filtre, recentrer l’échantillon avant de capturer des images. Enregistrez les images sous forme de fichiers TIFF non compressés et/ou dans le format de fichier natif du logiciel afin de préserver toutes les informations pertinentes.
Pour commencer l’analyse, ouvrez l’image avec ImageJ. Utilisez l’outil rectangle pour dessiner un rectangle autour de la principale région d’intérêt. Ensuite, sur la barre d’outils, sélectionnez l’image, allez zoomer et sélectionnez à la sélection.
La fenêtre d’imagerie zoome sur la zone sélectionnée. Ensuite, sélectionnez l’image, allez ajuster et sélectionnez luminosité/contraste. Pour améliorer la vue de la région de l’échantillon, ajustez le minimum, le maximum, la luminosité et le contraste de l’image.
Ces ajustements ne modifient pas les données scientifiques, ils permettent simplement une meilleure visibilité de la région échantillonnée. Maintenant, utilisez à nouveau l’outil rectangle et dessinez une boîte autour de la première nanoparticule à mesurer. La boîte ne doit être que légèrement plus grande que le disque aérosé de la nanoparticule.
Une fois sélectionné, allez analyser et sélectionnez la mesure. Une nouvelle fenêtre apparaît qui signale les intensités minimales, maximales et moyennes pour les pixels situés à l’intérieur de la boîte sélectionnée. En conservant la taille d’origine de la boîte, faites glisser la boîte dans une zone adjacente immédiatement à la particule où le contraste de fond est relativement faible et où aucune particule ou contaminant n’est présent.
Utilisez à nouveau l’outil de mesure pour déterminer l’intensité moyenne de la zone d’arrière-plan. Répétez ce processus pour chaque particule dans toutes les images de la série. Exportez ensuite les données vers une feuille de calcul pour calculer le contraste ou l’intensité de chaque particule sur toutes les longueurs d’onde et tous les angles.
Entrez dans l’équation suivante pour calculer le contraste de chaque particule. Enfin, tracez le profil spectral à une position de nanoparticule donnée en traçant des données avec la longueur d’onde le long de l’axe X et le contraste ou l’intensité le long de l’axe Y. Pour déterminer le réglage d’imagerie optimal, ces nanosphères dorées ont été photographiées à plusieurs réglages polariseurs.
À zéro degré, les particules apparaissent principalement blanches avec une bande foncée qui traverse leur section médiane. Ceci est révélateur de la polarisation croisée pour les échantillons de nanosphère. Lorsque le polariseur est tourné vers différents angles, les particules projettent des ombres sombres vers un coin.
Cependant, les valeurs de contraste des particules changent radicalement. Pour cet échantillon, le réglage d’imagerie optimal est avec un décalage polarisant de 10 degrés. Ici, la longueur d’onde est tracée contre le contraste des nanosphères d’or.
Chaque point de données représente une moyenne de 20 nanosphères pour chaque diamètre de particule. Le contraste de pointe pour chaque particule se déplace légèrement en fonction de sa taille. L’intensité et la rotation sont encore plus importantes avec des formes anisotropiques comme cette nanorod d’or.
Ici, la longueur d’onde est tracée contre l’intensité à deux paramètres polariseurs différents. Dans chaque cas, l’intensité du côté lumineux est beaucoup plus forte que celle du côté obscur. Le profil d’intensité d’une seule nanorod d’or à sa longueur d’onde localisée de résonance de plasmon de surface pendant la rotation de l’étape montre une grande différence d’intensité entre les côtés foncés et lumineux pendant que l’échantillon est tourné par 180 degrés.
L’imagerie par échantillon est extrêmement importante. Il faut à la fois de la diligence et de la patience de la part du microscopiste. Si vous effectuez une expérience qui nécessite de réinventer l’échantillon sur une série de jours, alors des repères tels que les marques de rayures sont essentiels pour déplacer votre région d’intérêt.
La microscopie DIC intéresse de plus en plus les chercheurs qui étudient les nanoparticules, en particulier dans les environnements dynamiques et cellulaires. Parce que DIC offre une résolution spatiale optimale, en particulier dans des environnements d’échantillonnage complexes.
