Ce protocole peut être employé pour créer les xénogreffes patient-dérivées qui récapitulent l’histopathologie des malformations veineux. Cela a également été autorisé à effectuer nos tests thérapeutiques précliniques. Cette technique fournit un système NVivo rapide et fiable qui permet une surveillance quotidienne de la croissance des cellules endothéliales directes du patient et de la réponse à la thérapie expérimentale.
Cette méthode pourrait être facilement adaptée pour étudier d’autres types d’anomalies vasculaires ou lymphatiques. Commencez par préparer la suspension cellulaire pour injection. Essayez de trypsiniser les cellules endothéliales avec cinq millilitres de préchauffé 0,05%tripsin-EDTA à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.
Neutraliser le tripsin et en ajoutant cinq millilitres d’EGM et de recueillir les cellules en tube conique de 150 millilitres. Centrifugez-le à 400 fois G pendant cinq minutes puis aspirez le supernatant et resuspendez les cellules en trois millilitres d’EGM. Comptez les cellules à l’amiomètre.
Aventurez le volume avec le numéro de cellule désiré dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et pelletez à nouveau les cellules par centrifugation. Aspirer le supernatant en laissant un petit volume pour desserrer la pastille cellulaire. Resuspendez la pastille cellulaire avec 220 microlitres de BMEM par injection.
Bien mélanger la suspension cellulaire sur la glace en s’assurant d’éviter de créer des bulles. Aspirez le mélange de culture cellulaire BMEM dans une ouverture de seringue d’un millilitre en tirant le piston. Vous verrouillez une aiguille stérile de calibre 26 à la seringue et garderez les seringues préparées à plat sur la glace avant l’injection.
Après s’être assuré que la souris a correctement anesthésié placez-la sur son estomac et désinfectez la région d’injection avec 70% d’éthanol. Roulez doucement la seringue préparée pour résusuer les cellules réglées. Flocons de bulles à l’extrémité de la seringue et expulser un petit volume de la suspension cellulaire.
Pincez la peau au site d’injection pour créer une tente comme la structure. Ensuite, insérez l’aiguille juste sous la peau et assurez-vous que l’aiguille n’est que la peau profonde en libérant la peau pincer pour empêcher l’injection dans le tissu musculaire. Tenir l’aiguille régulièrement injecter soigneusement 200 microlitres de la suspension cellulaire pour créer une petite masse sphérique.
Prenez soin d’éviter d’injecter la suspension cellulaire dans le muscle. Mesurez la longueur et la largeur de chaque prise à l’l’insurmater. Alignez les bouchons de xénogreffe disséqués sur une planche à découper à côté d’une règle et prenez une image pour enregistrer la vascularité brute des lésions.
Ensuite, fixez les bouchons en les vantant en formaline de 10% pendant la nuit à température ambiante. Après dissection, les bouchons de lésion sont traités pour l’analyse histologique et tachés pour UEA-1 pour détecter les cellules endothéliales dérivées de l’homme dans le bouchon. Prenez cinq images HPF par section de lésion avec un microscope de champ lumineux à 20 X grossissement dans un modèle de plan X dans la section de lésion pour éviter le chevauchement.
Assurez-vous d’inclure une barre d’échelle sur les images prises. Ouvrez les images HPF dans l’image J.To calibrer les pixels de la barre d’échelle, utiliser l’outil en ligne droite et passer au-dessus de la barre d’échelle. Convertissez ensuite les pixels mesurés en millimètres en cliquant sur Analyser et définir l’échelle.
Cliquez ensuite sur Analyser les mesures définies et sélectionner la zone et ajouter à la superposition. Mesurez la superficie totale du FPH à l’aide de l’analyse et de la mesure en sauvant cette mesure pour la quantification. À l’aide de l’outil de sélection des mains libres, décrire manuellement le canal vasculaire positif UEA-1.
Cliquez sur Analyser et mesurer pour quantifier la zone décrite. Mesurer tous les canaux vasculaires dans le HPF. Répétez le processus pour les cinq HPF pris dans chaque section et transférez les valeurs à Excel pour une analyse plus approfondie.
Calculez ensuite le pourcentage de zone vasculaire et de densité vasculaire selon les instructions manuscrites. En utilisant ce protocole, les bouchons de lésion avec tie2 ou PIK3CA cellules endothéliales mutantes hyperactives sont visiblement vascularisés et perfusés dans les sept à neuf jours après l’injection. Les bouchons de lésion ressemblent étroitement aux dispositifs histopathologiques du tissu humain de VM et de grands canaux vasculaires alignés par une fine couche des cellules endothéliales sont visibles.
Ces structures vasculaires contiennent généralement des érythrocytes confirmant l’anastomose fonctionnelle avec la vascularisation de souris hôte. La coloration immunohistochimique utilisant la lectine spécifique humaine UEA-1 confirme que les cellules tapissant des régions vasculaires sont dérivées des cellules implantées humaines plutôt que de la vascularisation de souris. Après cette procédure, la coloration supplémentaire des sections de lésion pour des marqueurs de prolifération ou d’apoptose peut être exécutée pour analyser des effets spécifiques des traitements expérimentaux.
Ce modèle scénographique a été utilisé pour des études précliniques de nouvelles thérapies pour la malformation veineuse, comme l’inhibiteur du mTOR rapamycine, qui a montré son efficacité dans plusieurs essais cliniques pour les patients atteints de VM.
