PDX произвел революцию в экспериментальных доклинических исследованиях рака. Теперь мы можем имитировать в лаборатории то, что происходит у пациентов. И теперь мы можем работать над тем, как преодолеть сопротивление и как в долгосрочной перспективе мы можем увеличить выживаемость пациентов.
Демонстрацией процедуры будет Мин Сяо. Для начала перенесите ранее собранную ткань меланомы в стерильную чашку Петри. Работая с хирургическими ножницами, лезвием скальпеля и типсами, сначала удалите нормальную ткань из нормальной ткани как можно больше.
А затем удалить некротические ткани, выявленные бледно-бело-иш ткани, расположенные в центре опухоли. Затем используйте скальпель, чтобы подраздеть начальный кусок опухоли примерно на равные части для хирургической имплантации мыши. Если опухолевая ткань слишком трудная для механической диссоциации, используйте скальпель, чтобы измельчить куски опухоли как можно тоньше, чтобы сформировать суспензию.
Перенесите суспензию в 50-миллилитровую трубку с сбалансированным солевым раствором холодного Хэнка без ионов кальция и магния. Центрифуга при 220 раз g в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта, повторно приостановить суспензии в 10 миллилитров нагревается, свежие средства пищеварения на один грамм опухолевой ткани.
Поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 20 минут и энергично смешивать каждые пять минут с одноразовой пипеткой. Вымойте суспензию с использованием до 50 миллилитров HBSS, центрифуги при 220 раз g в течение четырех минут при четырех градусах по Цельсию, а затем удалить супернатант. Добавьте пять миллилитров предварительно разогретого буфера TEG на один грамм опухолевой ткани, встряхните, чтобы аккуратно приостановить, и поместите трубку на 37 градусов по Цельсию в течение двух минут, без смешивания.
Чтобы утолить трипсин, добавьте по крайней мере один равный объем холодного окрашивания и центрифуги при 220 раз g в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта добавьте 10 миллилитров окрашивающих средств на один грамм опухолевой ткани и повторно приостановите гранулы трубами вверх и вниз. Фильтр его через 40 микрометровый ситечко клеток, чтобы получить одноклеточную подвеску для инъекций мыши.
Для имплантации хирургического иссечения или хирургической биопсии ткани, первый бритья волос из нижней части спины NSG шесть-восемь недель анестезировал мышей, в результате чего примерно от 1,5 сантиметров до трех сантиметров области без волос. Подготовка опухоли куски, и разделить опухоль суспензии в Петри на отдельные курганы для хирургической имплантации. Используя лезвие скальпеля, сделайте разрез длиной около пяти миллиметров по центру задней части мыши.
С одной парой типсов, жизнь до кожи на стороне разреза напротив оператора. Ножницами в другой руке отделяйте кожу от мышечного слоя, аккуратно разрезая фасциальную мембрану небольшими ножницами, создавая тем самым карман для опухолевой ткани. Используйте лезвие скальпеля, чтобы забрать один опухолевый патрон, а также один отдельный курган ткани опухолевой суспензии, и аккуратно поместите ткань в созданный карман.
Затем добавьте 100 микролитров искусственной внеклеточной матрицы на насыпь опухолевых тканей в кармане. Используя две пары типсов, поднимите разрез на обоих концах так, чтобы края раны сблизились. Затем нанесите один или два зажима раны, чтобы закрыть рану.
Подкожно вводят от одного до пяти миллиграммов на килограмм анальгетики. Когда заживление полностью, примерно через семь дней, удалить раны клипс. Мониторинг мышей один раз в неделю, чтобы проверить на ощутимые опухоли.
Как только опухоли достигают желаемого объема, используйте хирургические миппы, чтобы поднять кожу, прилегающую к опухоли усыпляемой мыши, и сделать горизонтальный разрез с помощью изогнутых ножниц. Используйте тупую технику разделения, чтобы мобилизовать кожу по обе стороны опухоли и над опухолью, подвергая опухоли. Используйте ножницы и лезвие скальпеля, чтобы отделить опухоль от фасции.
Вырежьте опухоль и перенесите ее в стерильную чашку Петри. Разрежьте опухоль на мелкие кусочки и удалите некротические ткани из опухоли. Чтобы банк опухолевых тканей для будущей имплантации, принять два-три небольших кусочков опухоли и фарш их на куски меньше, чем один на один миллиметр.
Перенесите весь рубленый фарш в двухмилитарную криогенную мерзкую. Добавить один миллилитр замораживания средств массовой информации и хорошо перемешать. Поместите флаконы в предварительно охлажденный изопропанол основе ячейки замораживания контейнера на сухом льду, хранить контейнер в минус 80 градусов по Цельсию морозильник на ночь, а затем передать флаконы для хранения жидкого азота.
Чтобы заморозить ткани для анализа ниже по течению, поместите кусочки опухолевой ткани в криогенный флакон, немедленно поместите криогенную мерзку в жидкий азот и храните флаконы в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию. При сопоставлении трех различных методов выращивания опухолевой ткани наиболее успешной была одноклеточная суспензия опухолевых клеток с использованием энзиматического пищеварения. Помимо обеспечения более быстрого роста опухоли, было также достаточно для одной первоначальной опухоли, которая будет расширена на 10 до 20 мышей, в то время как опухоль патрон и суспензии метод может быть расширена только на пять-10 мышей.
Меланома пациента полученных ксенотрансплантата модели часто отражают чувствительность препарата пациента отображается при терапии. Ксенотрансплантат, полученный от пациента меланомы, который первоначально ответил на ингибитор BRAF, но в конечном итоге рецидив, также отображается первоначальная чувствительность к ингибированию белка BRAF, плюс ингибитор киназы MEK, но опухоли в конечном итоге рецидив. Очень важно заботиться при подготовке ткани PDX для банковского дела, так как это обеспечит успех в будущих расширениях PDX, испытаниях терапии, а также характеристике.
С материалом PDX, одноклеточной РНК секвенирования, всего экзома секвенирования, и протеомной характеристики, являются одними из многих методов нашей лаборатории рычаги для вскрытия резистентности к терапии. Техника PDX позволяет исследователям исследовать устойчивость к терапии с помощью опухолевых клеток, которые лучше резюмируют биологию опухоли у пациента по сравнению с традиционными моделями рака, выращенными на пластике. Это преимущество позволяет получить более прогностический анализ.
Исследователи должны всегда заботиться и использовать биобезопасность уровне два меры предосторожности при обработке опухолевых тканей, полученных от человека пациента.
