Notre protocole fournit une approche efficace et reproductible pour évaluer et quantifier les événements phagocytiques chez les oursocytes. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons quantifier les événements phagocytiques dans les hémocytes individuels qui nous permet de détecter les variations des processus phagocytiques chez les génotypes chez les mouches individuelles. Effectuer des dissections peut être difficile, donc lors de l’exécution de cette technique pour la première fois, la pratique des dissections autant que possible avant d’effectuer la procédure complète.
Commencez par préparer des aiguilles en verre pour l’injection. Remplissez une seringue d’un millimètre d’huile minérale et fixez l’aiguille hypodermique de calibre 30 fournie avec le nano-injecteur. Insérez l’aiguille de calibre 30 dans l’extrémité émoussée d’une aiguille capillaire tirée et remplissez-la d’huile minérale.
Retirez lentement l’aiguille de calibre 30 en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est formée. Retirer le collet et placer l’anneau O scellé avec l’indentation vers le haut. Placez le plus grand anneau O sur le piston en métal, puis rattachez le collet sans serrer.
Insérez le piston métallique dans l’extrémité émoussée de l’aiguille en verre remplie d’huile et poussez-le doucement vers le bas en l’insérant dans le plus grand anneau O. Serrez ensuite le collet jusqu’à ce qu’il soit bien sûr. Après avoir rempli l’aiguille de particules fluoro ou sensibles au pH, injecter les mouches dans la plaque sternopleural du thorax.
L’injection est réussie si le colorant vert va dans la mouche. Placez les mouches injectées dans un nouveau flacon de nourriture en notant l’heure à l’injection de la première et de la dernière mouche. Mentez le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient rétablies pour les empêcher de rester coincées dans la nourriture.
Orientez le côté ventral de mouche vers le haut sous un stéréomicroscope disséquant. Puis insérez une épingle à insectes dans le thorax et une autre à travers l’extrémité la plus postérieure de l’abdomen près des organes génitaux. Une fois que toutes les mouches ont été épinglées, utilisez un pipet de transfert pour ajouter suffisamment de supports de dissection pour couvrir les mouches.
Retirez la tête avec des ciseaux cuticules, et faire une incision horizontale directement au-dessus de la broche postérieure dans l’abdomen, puis un autre à l’extrémité la plus antérieure de l’abdomen. Faire une incision verticale reliant les deux incisions horizontales qui ouvrira la cavité abdominale. Utilisez des forceps pour enlever les organes et les tissus internes, en vous assurant d’éviter le vaisseau dorsal.
Si nécessaire, utilisez des broches supplémentaires pour fixer les extrémités coupées de la cuticule. Retirez ensuite le thorax avec les ciseaux cuticules. Jetez le média de dissection et remplacez-le par un millilitre de 4%PFA, protégeant les dissections de la lumière autant que possible.
Fixer les dissections pendant 15 minutes à température ambiante tout en basculant à 20 rpm. Retirez ensuite le fixatif et ajoutez un millilitre de 1X PBST. Si désiré, tacher les dissections avec des anticorps.
Après avoir monté les cuticules sur une lame de microscope, utilisez des forceps pour les orienter vers le haut du côté ventral et assurez-vous que le vaisseau dorsal est visible. Les mouches jeunes et âgées ont été évaluées pour la capacité spécifique à l’âge d’effectuer la phagocytose par imagerie fluorescente des hémocytes le long du vaisseau dorsal. Un anticorps contre la péricardine a été utilisé pour s’assurer que seules les cellules le long du vaisseau dorsal ont été comptées.
Étant donné que les particules E.coli étiquetées fluorescentes ont une longueur d’un micromètre et que les hémocytes ont 10 micromètres de diamètre, seuls les événements fluorescents d’un diamètre de 10 micromètres centrés sur un noyau positif au DAPI ont été comptés. Le logiciel ImageJ a ensuite été utilisé pour quantifier les événements. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de visualiser que la mouche a été effectivement injectée et de se rappeler que le moment est critique.
L’achèvement des injections et des dissections en temps opportun aidera à minimiser les erreurs expérimentales et les variations possibles du taux phagocytique. Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer une variété de sujets de recherche, y compris les questions concernant l’immunité cellulaire, les différentes populations de cellules sanguines ou la distinction phagocytose de la production de AMP lors d’une réponse immunitaire réussie.
