Physiologiquement intact muscle squelettique de la souris peut produire des modèles de diffraction des rayons X de haute qualité contenant beaucoup d’informations structurelles qui peuvent fournir un aperçu des processus physiologiques. La diffraction aux rayons X est la seule technique qui permet l’acquisition d’informations structurelles à haute résolution à partir de tissus musculaires vivants dans des conditions physiologiques réelles en temps physiologique réel. De nombreuses maladies musculaires sont héréditaires.
Avec une disponibilité accrue pour modifier génétiquement la plupart des modèles de myopathies, la diffraction aux rayons X peut fournir des aperçus structurels des mécanismes de la maladie et indiquer des stratégies thérapeutiques. La plupart des muscles extenseurs digitorum longus et soleus sont particulièrement pratiques à cet effet. Mais beaucoup d’autres muscles chez les petits animaux peuvent être disséqués intacts et manipulés de la même manière.
Avant de commencer la procédure, allumez le transducteur combiné de force motrice, le contrôleur transducteur de force motrice avec un stimulateur de courant biphasique de haute puissance, et un système de contrôle informatique de commande de données d’acquisition de données. Ensuite, vaporisez la peau sur le membre postérieur de la souris avec la solution froide de Ringer et utilisez des ciseaux de dissection fine pour couper la peau autour de la cuisse. À l’aide des forceps numéro cinq, tirez rapidement la peau vers le bas pour exposer les muscles et amputer le membre postérieur.
Placez le membre dans un plat disséquant recouvert d’élastomères contenant la solution oxygénée de Ringer et placez le plat sous un microscope à disséquer des jumelles. Pour récolter le muscle soleus, épinglez le membre postérieur avec le muscle gastrocnemius orienté vers le haut. Utilisez des ciseaux fins pour couper le tendon distal du groupe musculaire gastrocnemius/soleus.
Coupez le fascia de chaque côté du muscle gastrocnemius pour permettre aux muscles d’être soulevés doucement et lentement loin de l’os. Puis libérez le tendon proximal du muscle soleus. Épinglez le groupe musculaire contenant le muscle gastrocnemius et le tendon distal dans le plat.
Soulevez doucement le muscle soleus via le tendon proximal pour le séparer du muscle gastrocnemius, laissant autant de tendon distal soleus intact que possible. Pour récolter le digitorum longus extenseur ou le muscle EDL, épinglez le membre postérieur dans le plat avec le muscle antérieur tibialis orienté vers le haut et coupez le fascia le long du muscle antérieur tibialis. Utilisez des forceps pour tirer le fascia clair et couper le tendon distal du muscle antérieur tibialis.
Soulevez le muscle antérieur tibialis et coupez-le soigneusement sans tirer sur le muscle EDL, et coupez le côté latéral du genou pour exposer les deux tendons. Coupez le tendon proximal, nous laissant une grande partie du tendon que possible encore attaché au muscle et tirez doucement sur le tendon pour soulever le muscle EDL. Ensuite, coupez le tendon distal une fois qu’il est exposé.
Pour monter le muscle récolté, épinglez le muscle par l’intermédiaire des tendons et coupez autant de graisse supplémentaire, fascia et tendon que possible. Insérez un tendon dans un nœud pré-attaché et utilisez des forceps de suture pour attacher la suture étroitement. Attachez le deuxième nœud autour du crochet métallique et répétez la procédure à l’autre extrémité du tendon.
Attachez ensuite le crochet court au fond de la chambre expérimentale, et le long crochet au moteur transducteur à double mode. Bulle de la solution dans la chambre expérimentale avec 100% d’oxygène. Pour optimiser le protocole de stimulation et la longueur musculaire ajuster les micro manipulateurs attachés au moteur transducteur pour générer une tension de base entre 15 à 20 millinewtons pour trouver les meilleurs paramètres de stimulus pour étirer le muscle.
Réglez la tension de stimulation à 40 volts. Le courant de stimulation sera systématiquement augmenté jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la force de contraction. Pour trouver la longueur optimale, augmenter la longueur musculaire et activer le muscle avec une seule secousse jusqu’à ce que la force active cesse d’augmenter.
Effectuez une contraction tétanos d’une seconde pour tester le montage et étirer le muscle jusqu’à la force de base optimale au besoin. Enregistrez ensuite la longueur musculaire en millimètres avec un étrier numérique. Pour déterminer la position du faisceau, utilisez un morceau de papier sensible aux rayons X qui produit une tache sombre en réponse aux rayons X et un générateur de réticule vidéo pour créer un réticule aligné avec la marque de brûlure sur le papier.
À l’aide de l’interface utilisateur graphique fournie par BioCAT au positionneur de l’échantillon, centrez le muscle sur la position du faisceau et déplacez l’étape de l’échantillon pour osciller la chambre de l’échantillon à 10 à 20 millimètres par seconde pour répartir la dose de rayons X sur tout le muscle pendant l’exposition. Observez l’échantillon pendant qu’il se déplace pour éviter les grandes régions de fascia qui contiennent du collagène et pour s’assurer qu’il reste illuminé pendant tout le chemin de son voyage. Armez le détecteur et attendez la gâchette du système d’acquisition de données.
Déclenchez ensuite les données mécaniques et radiographiques en même temps pour les synchroniser. Les modèles de rayons X seront recueillis en continu tout au long du protocole avec un temps d’exposition de 10 millisecondes et une période d’exposition de 50 millisecondes. Dans cette contraction tétanique isométrique représentative, le muscle EDL a été maintenu au repos pendant 0,5 seconde avant d’être activé pendant une seconde, suivi d’une relaxation de 1,5 seconde.
Le modèle de diffraction des rayons X musculaires peut donner des informations structurelles de résolution nanométrique à partir de structures à l’intérieur du sarcomere. Les lignées de couches à base de myosine contenant des filaments épais sont fortes et nettes dans les modèles du muscle de repos, tandis que les lignes de couche à base d’actine contenant des filaments minces sont plus importantes dans les modèles du muscle contractant. Les modèles de différence obtenus en soustrayant le modèle de repos du modèle de contraction peuvent faire la lumière sur des changements structurels pendant le développement de force dans le muscle sain et maladie.
En suivant ces changements structurels à l’échelle de temps milliseconde des événements moléculaires pendant la contraction et la relaxation de muscle, les modèles de diffraction de rayon X peuvent révéler l’information structurale substantielle. Dans cette analyse représentative des réflexions équatoriales à l’aide de la routine équateur dans le paquet Open source MuscleX, le rapport d’intensité équatoriale indique la proximité de la myosine à l’actine dans le muscle au repos et est étroitement corrélé au nombre de ponts croisés attachés dans le contrat du muscle squelettique murin. La distance entre les deux 1, 0 réflexion est inversement liée à l’espacement de l’interfilament.
Une dissection propre est la clé d’une expérience de radiographie musculaire intacte réussie, alors essayez d’éviter tout dommage mécanique pendant la préparation musculaire. N’importe quel protocole physiologique standard avec des muscles entiers peut être mis en œuvre dans ces expériences et peut être utilisé pour étudier l’activation musculaire, la relaxation et le comportement inter-pont pendant l’éphémère mécanique rapide. La manipulation génétique des souris devient de plus en plus sophistiquée.
De nouveaux modèles de souris transgéniques permettront de créer des expériences plus spécifiques et perspicaces pour indiquer de nouvelles orientations thérapeutiques pour les myopathies humaines.
