La nécrose myofiber est caractéristique des désordres neuromusculaires multiples et joue un rôle central dans la pathogénie. Une méthode spécifique et fiable pour évaluer la dégénérescence musculaire est importante pour le diagnostic et la recherche translationnelle. Cette technique extrêmement adaptable permet l’étiquetage de l’antigène multiple en même temps dans la même section à l’intérieur de ce myofibers.
Il est possible avec des dyes vitales. La coloration H&E est une méthode empirique qui n’est pas adaptable à une conjugaison fiable et reproductible. La coloration d’absorption d’IgG, cependant, est spécifique pour des cellules de muscle nécrotiques et applicable aux biopsies humaines.
Cette technique peut fournir un aperçu de tous les désordres neuromusculaires caractérisés par la myonecrose. Après avoir enlevé les cheveux de la jambe d’intérêt placer l’animal mdx mâle de quatre semaines dans la position supine et fixer les pattes à un panneau de liège. À l’aide de ciseaux ou de forceps de précision, retirez la peau de la jambe du pied au genou pour exposer toute la longueur du tibia et du tibialis antérieur.
Utilisez les ciseaux pour faire une incision entre le tibia et le tibialis antérieur. Utilisez des forceps pour enlever soigneusement la couche d’épimysium de la surface du muscle. À la cheville, utilisez les forceps pour isoler le tendon antérieur tibialis des autres tendons et tirez doucement vers le haut sur le tendon pour l’isoler du tibia et des muscles environnants.
Lorsque le ventre antérieur tibialis a entièrement séparé tenir le tendon vers le haut de sorte que seule la partie proximale du muscle antérieur tibialis est attaché au genou. Et couper doucement le tendon proximal aussi près que possible de la rotule. Placez le tibialis antérieur sur un morceau de gaze légèrement amorti avec de la solution saline pour éviter le séchage.
Tremper partiellement un bécher contenant de 70 à 100 millilitres d’isopentane dans un récipient d’azote liquide jusqu’à ce que l’isopentane au fond du bécher devienne un solide blanc. Pré-étiqueter soigneusement l’autre côté des bouchons afin que la biopsie puisse être correctement identifiée après congélation, et ajouter environ 0,5 millilitres de gomme de tragacanth sur un morceau circulaire de liège de 20 x 11 par 8 millimètres. Utilisez des forceps pour intégrer l’antérieur tibialis dans le côté du tendon distal de la gencive vers le haut.
Tenir le muscle avec son axe perpendiculaire à la surface du liège. Au moins la moitié du côté tendin de l’antérieur tibialis doit rester découvert par la gencive. Puis trempez rapidement le liège avec le muscle incorporé dans l’isopentane réfrigéré et non congelé pendant environ deux minutes pour permettre une congélation complète.
Obtenez des sections du tissu congelé, réglez la température du cryostat à moins 25 degrés Celsius et utilisez le composé optimal de température de coupe pour fixer le tissu sur le bloc de coupe cryostatique. Couper l’échantillon jusqu’à ce que le ventre musculaire soit atteint. Obtenez sept à dix sections de micromètres recueillant au moins deux sections par glissière de verre plaçant les glissières à température ambiante au fur et à mesure que les sections sont capturées.
Laissez sécher les tissus pendant au moins 20 minutes à température ambiante dans un environnement ventilé. Ensuite, stockez la section à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils tachent. Immunolabel les tissus.
Tout d’abord, décongeler les glissières à température ambiante pendant au moins 15 minutes dans l’environnement ventilé. Ensuite, délimité les sections avec un stylo hydrophobe. Fixer les tissus avec 2% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes dans une chambre humide.
À la fin d’une fixation rincer les sections avec deux lavages de 5 minutes en PBS frais par lavage. Bloquez toute liaison non spécifique avec 10% sérum de chèvre dilué dans PBS. Après 1 heure à température ambiante étiqueter les sections avec un anticorps primaire d’intérêt, dilué dans 5% sérum de chèvre pendant 2 heures à température ambiante.
À la fin de l’incubation, rincer les glissières avec trois lavages de 5 minutes dans PBS suivre en étiquetant avec le fluorophore approprié conjugué anticorps secondaires pendant 45 minutes à température ambiante protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les toboggans avec trois lavages de 10 minutes en PBS. Montez la section avec un support fluorescent contenant 100 nanogrammes par millilitre de DAPI et un glissement de couverture.
Ensuite, séchez les glissières pendant la nuit à quatre degrés Celsius avant l’imagerie. Les muscles antérieurs Tibialis des souris mdx âgées de quatre semaines présentent souvent des profils hétérogènes, y compris des zones mal affectées dans les zones dégénérantes et régénérantes ensemble dans la même section transversale. Les zones musculaires peu affectées contiennent des myofibers de grande taille et homogènes et des noyaux à faible densité qui sont principalement situés à la périphérie ou entre les myofibers.
Les myofibers positifs d’IgG sont généralement absents dans de telles régions de santé ou légèrement affectées tandis que l’immunoréactivité d’IgG dans les myofibers indique myonecrosis. Les myofibers nouvellement formés sont présents à une petite taille à leurs premiers stades de régénération s’agrandissant progressivement pendant que les progéniteurs de muscle fusionnent dans contribuent à la cellule syncytial. Au cours de ce processus, les myonucléi restent au centre du tissu régénérant avec des grappes de petits myofibers centralement nucléés indiquant myofibers récemment régénérés Pour minimiser le risque d’artefacts, il est important de garder dans les muscles droits lors de la congélation du tissu et à la bonne température.
L’isopentane et le PFA doivent toujours être manipulés avec prudence et sous un capot de fumée.
