Ces études visent à fournir des systèmes modèles robustes et reproductibles pour effectuer des études spécifiques à l’orientation de l’épithélium intestinal. Les organoïdes apicaux peuvent être générés en grand nombre et sont prometteurs pour le criblage à haut débit. Les monocouches sont plus faciles à manipuler et offrent un accès aux signes apicaux et basaux.
Assurez-vous que la taille des organoïdes est de 150 à 250 micromètres de diamètre avant de commencer le protocole d’inversion. Retirez et jetez soigneusement le milieu de chaque puits contenant des organoïdes sans perturber le dôme ECM. Ajouter un millilitre de solution de dissociation glacée à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant une minute.
Délogez soigneusement les dômes en pipetant lentement avec une pointe enduite, en prenant soin de ne pas perturber et fragmenter les organoïdes. Transférer la suspension organoïde sur une plaque traitée avec une solution anti-adhérence et placer la plaque sur un agitateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, retirez la plaque et pipettez doucement la solution de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre recouverte d’une solution anti-adhérence.
Placez la plaque sur le shaker à quatre degrés Celsius pendant encore 30 minutes. Retirer la plaque et laisser les organoïdes se déposer par gravité pendant une à deux minutes à température ambiante. Une fois les organoïdes installés, retirez autant que possible la solution de dissociation et lavez-les en ajoutant 1,5 millilitres de DMEM F-12.
Laisser les organoïdes sédimenter et éliminer le surnageant. Répétez ensuite le lavage. Retirez autant que possible le DMEM F-12 et ajoutez 0,5 millilitres de milieu d’expansion organoïde intestinal.
Incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain effectuer un changement partiel de milieu en inclinant la plaque à un angle de 25 à 30 degrés et en enlevant le milieu le long de la paroi du puits en prenant soin de ne pas éliminer les organoïdes en suspension. Ajouter 0,4 millilitres de milieu d’expansion organoïde intestinale et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours.
Si des granulats se sont formés, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre recouverte d’une solution anti-adhérente pour ciselé les granulats en pipetant 20 fois de haut en bas tout en appuyant sur l’extrémité de la pointe au fond de la plaque. Ajouter un millilitre de Trypsine-EDTA préchauffé à 0,05 % pour ressusciter les organoïdes. Et bien mélanger pour assurer une suspension uniforme.
Ajoutez jusqu’à un millilitre supplémentaire de Trypsine-EDTA pour un grand nombre de cellules, ou s’il reste une quantité importante d’ECM. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes, puis bien mélanger avec une pipette d’un millilitre pour perturber les organoïdes afin qu’ils soient complètement dissociés en cellules simples ou petits fragments. Pour dissocier complètement des fragments ou des organoïdes entiers, poursuivez l’incubation avec la trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant encore trois à cinq minutes.
Une fois que les organoïdes sont suffisamment dissociés, ajoutez un volume égal de DMEM F-12 et pipettez de haut en bas pour bien mélanger. Inactivez la Trypsine-EDTA en ajoutant 10% FBS aux cellules. Fragments de centrifugeuse à 200 fois G pendant cinq minutes à deux à huit degrés Celsius.
Si les organoïdes dissociés n’ont pas réussi à granuler les cellules, mélangez soigneusement les cellules en les pipetant de haut en bas et en les centrifugant à nouveau. Retirez soigneusement autant de surnageant que possible. ne laissant que la pastille cellulaire.
Ressusciter les cellules dans 100 microlitres de milieu de différenciation organoïde intestinal pour chaque puits à ensemencer. Ajuster le volume de manière appropriée pour les tailles de puits plus grandes ou plus petites. Retirez les plaques revêtues de l’incubateur et retirez l’excès de solution de matrice de membrane de sous-sol de chaque puits.
Ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire au puits supérieur de chaque insert de culture cellulaire et 500 microlitres du milieu organoïde intestinal au puits inférieur. Incuber ensuite à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Remplacez le milieu dans les puits supérieurs et inférieurs tous les deux ou trois jours.
Pour établir une culture ALI, enlever le milieu des puits supérieurs et inférieurs, et ajouter un milieu de différenciation organoïde intestinal frais au puits inférieur en laissant le puits supérieur vide. Les organoids intestinaux cultivés avec le milieu intestinal d’expansion organoïde ont montré une morphologie cystique. Lorsque l’ECM est éliminé, certains organoïdes ont tendance à s’agréger au cours des trois premiers jours et doivent être purs pour augmenter le nombre d’organoïdes.
Les organoïdes intestinaux cultivés dans l’ECM ont continué à se développer et à montrer la formation spontanée des structures de bourgeonnement secondaires. Organoids maintenu pendant cinq jours en l’absence de la matrice extracellulaire a montré les formes allongées, cystiques, et irrégulières. L’expression des marqueurs atypiques, tels que le villin et le ZO-1 a été détectée le côté externe de l’épithélium qui a été exposé au milieu.
L’ECM a incorporé des organoids souillés pour des noyaux, villin, et ZO-1 démontrant une polarité basale apicale où le côté apical faisait face au lumen de l’organoid. Une fois que la monocouche a été établie, les cellules ont formé des jonctions serrées et une couche confluente. La couche confluente oriente également sa bordure de brosse contenant de la villine vers la face apicale de l’épithélium, formant des complexes multiprotéiques ZO-1 entre les cellules.
La transition vers une culture d’ALI a induit une différenciation supplémentaire avec des cellules de gobelet plus proéminentes qui ont été visualisées par coloration pour la protéine de mucine sécrétée MUC2 Pour induire l’inversion de polarité, il est crucial d’éliminer tout l’ECM sans perturber ou fragmenter les organoïdes. Les changements de support doivent également être effectués avec soin afin d’éviter d’éliminer l’un des organoïdes suspendus. S’assurer qu’il y a suffisamment de cellules individuelles pour l’établissement de la culture monocouche est un déterminant majeur de sa qualité.
Les fonctions spécifiques à l’apicale telles que l’absorption des nutriments ou les interactions avec les agents pathogènes de l’hôte peuvent maintenant être étudiées dans des systèmes pertinents qui répondent aux besoins des chercheurs.
