Ce travail a été soutenu par l&#39;USDA 1999-35212-8680 subventions, de 2005 à 01378, et 2010-04288-01, USDA fonds à formule et l&#39;État de Géorgie Subvention de recherche en médecine vétérinaire agricole. Le protocole décrit dans la présente publication a été développé pour une utilisation par les étudiants dans le cadre de cours de recherche dirigée: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L et 4960H BIOL à l&#39;Université de Géorgie et utilisés par les étudiants sur plusieurs projets de recherche en épidémiologie moléculaire dans l&#39;Maurer laboratoire. Nous tenons à remercier les nombreux étudiants de premier cycle qui ont effectué des recherches dans les laboratoires de Maurer et Lee, et notre chef de département, John Glisson pour soutenir nos efforts pour intégrer l&#39;enseignement de premier cycle à la recherche.

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La plupart disponibles dans le commerce des tests PCR pour la détection de gènes cibles Salmonella unique pour le genre (ex. invA). Cependant, tous les salmonelles sont égaux dans leur capacité à causer la maladie chez l&#39;homme ou de la prévalence dans les populations animales. La reconnaissance précoce des différences antigéniques de Salmonella LPS O-antigène et flagellinH1 et les antigènes H2 a conduit à la différenciation de Salmonella dans plus de 2500 sérovars en fonction de ces différences antigéniques. Il ya 46 différents antigènes O et 86 distinctes flagelline (H) des antigènes identifiés dans le genre Salmonella. Salmonella peuvent posséder un (H1) ou de deux différentes (H1 et H2) flagellines. La combinaison différente de O, H1 et H2 antigènes compte des sérotypes de Salmonella les 2500 aujourd&#39;hui reconnu. Un sérovar est attribué selon la formule antigénique dérivée de l&#39;identification de l&#39;individu antigènes O et H. La formule antigénique est écrit comme O: H1: H2, et où &quot;-&quot;, se réfère à l&#39;absence de H1 ou H2 flagelline et «NT» (non typables) pour Salmonella négatives pour l&#39;antigène O. Par exemple, le sérovar Typhimurium est attribué à un S. enterica isoler avec la formule antigénique B: i: 1,2 alors que Enteritidis est donnée à un isolat avec la D1 la formule: g, m: -. Cette variation antigénique dans la population de Salmonella est la manifestation extérieure de différences au niveau des nucléotides qui peuvent donc être facilement exploitée par PCR. Nous avons identifié les différences génétiques associés à des allèles O et H pour développer une PCR allélotypage pour identifier S. sérovars enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium (3). L&#39;attribution correcte et les rapports de Salmonella sérotype nécessite des tests pour tous les allèles associés à O: H1: formules antigéniques H2 pour Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), et Typhimurium (B: i: 1,2). Sans la connaissance de l&#39;allèle O ou antigène, la conclusion de la g H1, allèle m ne suffit pas nécessairement identifier les salmonelles isolat comme Enteritidis que d&#39;autres sérotypes de Salmonella les: Agona, en Californie, et à Montevideo, possèdent également cette même allèle. Alors que la PCR allélotypage a été initialement conçu pour détecter l&#39;avant mentionnés sérovars de Salmonella, ce test peut identifier 19 autres sérovars (tableau 3). Notre allélotypage PCR a été initialement conçu pour détecter les allèles O et H. En pratique, il est devenu plus pratique et rentable pour nous d&#39;identifier les O-antigène par agglutination sur lame, en utilisant O antisérum spécifique, plutôt que d&#39;effectuer l&#39;O allélotypage PCR lorsque l&#39;on travaille avec des cultures de Salmonella isolés. Cependant, nous ne recommandons d&#39;utiliser l&#39;O allélotypage PCR si votre laboratoire utilise cette PCR comme un écran (2) ou pour le typage des isolats de Salmonella soumis le FTA cartes (6), et comprennent une PCR Salmonella spécifique avec le premier écran d&#39;échantillons (4 ). Limiter le PCR allélotypage aux seuls échantillons qui sont identifiées comme Salmonella par PCR ou tests biochimiques / antigénique. Le protocole décrit dans cet article a été optimisé pour une utilisation avec le Rapidcycler Idaho Technology, un thermocycleur à air chaud qui permet de réduire les volumes de réaction et les conditions de réaction fonctionne en moins de temps que de nombreux thermocycleurs bloc de chauffage. Pour adapter ce protocole pour l&#39;utilisation avec un thermocycleur bloc chauffant peut exiger l&#39;optimisation des conditions de réaction empiriquement par l&#39;abaissement / élévation des températures de recuit; ajustant concentrations d&#39;amorces, ou ajuster les concentrations de MgCl 2. Par exemple, nous avons dû adapter le protocole pour le MJ Research PTC-200 thermocycleur comme suit. Travailler avec les volumes réaction décrite dans le tableau 1, le stock de travail concentrationof l&#39;ensemble d&#39;amorces i a été dilué à 2,5 uM, la température de recuit a été abaissé de 55 ° C à 45 ° C, temps d&#39;incubation et à la dénaturation, d&#39;hybridation et l&#39;extension des mesures a été allongée à 20 s pour la PCR i / g, m allélotypage. Ayant les contrôles positifs et négatifs appropriés sont essentiels dans le démarrage initial et d&#39;optimisation pour les PCR, y compris les protocoles publiés. Nous recommandons l&#39;acquisition de sérotypes de Salmonella les connus, spécifiquement anatum (E1: E, H: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) et Typhimurium (B: i: 1,2) et un laboratoire d&#39;Escherichia coli K12 (DH5a, LE393, JM109, etc ) comme contrôles positifs et négatifs, respectivement pour les tests de PCR allélotypage décrit dans cet article. Plusieurs de ces sérotypes de Salmonella les servira comme contrôles positifs ou négatifs, selon le allèle est testé. Certaines précautions et les directives doivent être suivies tout en effectuant ceci et tout autre diagnostic par PCR. Tout d&#39;abord, la séparation physiquede la préparation de modèles, PCR set-up, et électrophorèse sur gel est essentiel dans la prévention de possibles PCR report de contamination et de rapports erronés de faux positifs. En outre, l&#39;inclusion de contrôles appropriés sont nécessaires dans toute routine PCR comme ces contrôles d&#39;identifier les problèmes à mesure qu&#39;ils surviennent et d&#39;aider à l&#39;interprétation des résultats (5). Surtout, la cohérence est essentielle, notamment en ce qui concerne les conditions d&#39;électrophorèse pour les andestimation amplicon détection (produit PCR) de taille de l&#39;amplicon. Pour illustrer ce point, nous avons délibérément suspendu électrophorèse plus tôt que prévu à la figure 1A. Les standards de poids moléculaire (voies 1 et 13) et le contrôle positif (piste 2) ne sont pas suffisamment séparés pour estimer avec précision tailles ou d&#39;observer la séparation de fragments d&#39;ADN où il ya des petites différences (~ 50 pb) dans les tailles. Une séparation adéquate des fragments d&#39;ADN, en particulier les normes de poids moléculaire, est essentiel que les rapports positifs dépend de l&#39;estimation précise de la taille amplicon et de distinguer «vrai positif» de la non-spécifiques amplicons qui sont parfois observés dans le fonctionnement quotidien de toute la PCR (5 ). Par exemple, il ya un amplicon non spécifiques à la figure 1B, piste 7 (~ 700 pb de taille). Avaient été abandonnées par électrophorèse trop tôt, quand le front de colorant a été seulement au point à mi-chemin dans le gel d&#39;agarose, il y aurait peu de différenciation entre 500 pb et 700 pb des fragments d&#39;ADN. Par conséquent, l&#39;échantillon dans le couloir 7 aurait été indiqué à tort comme positive pour les deux i et g, m allèles. Enfin, on doit reconnaître les limites associées à toute épreuve. Plusieurs des PCR H1/H2 allélotypage n&#39;ont pas le pouvoir de discrimination subtile à discerner des différences génétiques dans allèles appartenant à l&#39;H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 complexe antigène; e, n, x / e , n, Z15 complexe antigène et le complexe antigène G H1, qui comprend le g, m allèle. Un ou deux changements d&#39;acides aminés représentent les épitopes différents présents dans ces antigènes flagellaires. Il était donc difficile pour nous de concevoir des amorces qui pourraient exploiter ces différences, parfois seule paire de base dans la séquence du gène flagelline (3). Par exemple, Salmonella sérovars Dublin (D1: g, p: -) et Berta (D1: f, g, t: -) sont également positifs par PCR avec nos g, mallelotyping amorces. Les amorces H2 allélotypage ne peut pas distinguer Typhimurium (B: i: 1,2) de Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) de Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), ou Remo (B: r: 1,7), ou Hadar (C2: z10: e, n, x) de Glostrup (C2: z10: E, N, Z15). Alors que la probabilité de rencontrer certains de ces sérotypes: Lagos, Bradford, Winneba, Remo ou Glustrup est distant, c&#39;est une possibilité et nécessite soit en fournissant disclaimer sur la limitation des essais »ou un autre test de confirmation. En conclusion, cette sérotypage basé sur la PCR identifie rapidement S. enterica sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium, et O, H1, H2 et allèles associés à 19 sérovars supplémentaires. Ce dosage est rapide, efficace alternative à l&#39;approche microbiologique traditionnelle à Salmonella sérotype.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du produit </th><th> Tapez </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaire </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Tubes Microfuge </td><td> 1,5 ml de capacité </td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> 200 la preuve </td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Année de biologie moléculaire </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable; PCR uniquement) </td></tr><tr><td> 10 x tampon PCR: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td> (Tampon est livré avec la BSA, Ficoll et tartrazine) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Des amorces de PCR </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Taq ADN polymérase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Pipettes capillaires </td><td> Volume de 10 ul </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rapide Cycler </td><td></td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Faible TEE; année de biologie moléculaire </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> 50 X tampon TAE ou TBE 5X Buffer </td><td></td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Le bromure d&#39;éthidium </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Horizontale, la chambre submersible électrophorèse sur gel avec de la moisissure sur gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Alimentation </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc système </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Matériaux

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Commerciale actuelle des tests PCR pour identifier les gènes cibles Salmonella unique de ce genre. Cependant, il ya deux espèces, six sous-espèces, et plus de 2500 sérotypes de Salmonella les différents, et tous ne sont pas égaux dans leur signification pour la santé publique. Par exemple, trouver S. enterica sous-espèce de l&#39;Arizona IIIa sur une ferme couche de table de l&#39;œuf est insignifiant comparé à l&#39;isolement de S. enterica sérotype Enteritidis, je sous-espèces, la principale cause de salmonellose liée à la consommation d&#39;œufs de table. Sérovars sont identifiés sur la base des différences antigéniques des lipopolysaccharides (LPS) (antigène O) et la flagelline (H1 et H2 antigènes). Ces différences antigéniques sont l&#39;aspect extérieur de la diversité des gènes et allèles du gène associé à ce phénotype. Nous avons développé une allélotypage, la PCR multiplex que les touches sur les différences génétiques entre les quatre principaux S. enterica sous-espèce de sérovars j&#39;ai trouvé dans la volaille et associés aux maladies humaines importantes aux États-Unis. Les paires d&#39;amorces de PCR ont été ciblées pour les principaux gènes ou des séquences uniques d&#39;un sérotype de Salmonella spécifique et destinée à produire un amplicon avec la taille spécifique pour ce gène ou allèle. Salmonella sérovar est attribué à un isolat basée sur la combinaison des résultats des tests PCR pour LPS spécifiques et allèles du gène flagelline. La PCR multiplex décrit dans cet article sont spécifiques pour la détection de S. enterica sous-espèce, je sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium. Ici, nous montrent comment utiliser les PCR multiplex pour identifier sérovar Salmonella pour un isolé.

Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Nous décrivons un multiplex pour la détection rapide de Salmonella enterica sérovars, Hadar, Heidelberg et Typhimurium PCR. Sérotypes de Salmonella les particuliers peuvent être identifiés, en ciblant un multiplex PCR pour les gènes et les séquences uniques à la grappe biosynthèse de l&#39;antigène O et la flagelline d&#39;un sérovar donné. Sérovar est affecté ensuite à une Salmonella isoler basé sur l&#39;apparence des amplicons spécifiques de taille, (produit de PCR) correspondant à l&#39;allèle cible.

Une PCR pour l&#39;identification allélotypage Salmonella enterica Sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K vues.  University of Georgia. Nous décrivons un multiplex pour la détection rapide de Salmonella enterica sérovars, Hadar, Heidelberg et Typhimurium PCR. Sérotypes de Salmonella les particuliers peuvent être identifiés, en ciblant un multiplex PCR pour les gènes et les séquences uniques à la grappe biosynthèse de l'antigène O et la flagelline d'un sérovar donné. Sérovar est affecté ensuite à une Salmonella isoler basé sur l'apparence des amplicons spécifiques de taille, (...

Vidéo: An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

L&#39;identification des gènes induite par une dysrégulation de Kaposi associé au sarcome de Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Recherche

Immunologie et infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. 
We generated model xenograft tumors in mice by subcutaneous injection of a human ovarian cancer cell line, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). 
We transformed attenuated strains of S. typhimurium bacteria (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) with a constitutively expressed luciferase (luxCDABE) plasmid for visualization2. These strains specifically colonize tumors while remaining essentially non-virulent to the mouse1. 
Once measurable tumors were established, bacteria were injected intravenously via the tail vein with varying dosage. Tumor-localized, bacterial gene expression was monitored in real time over the course of 60 hours using an in vivo imaging system (IVIS). At each time point, tumors were excised, homogenized, and plated to quantitate bacterial colonies for correlation with gene expression data. 
Together, this data yields a quantitative measure of the in vivo growth and gene expression dynamics of bacteria growing inside tumors.

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. This video covers tumor cell preparation and implantation, bacteria preparation and injection, whole-animal luminescence imaging, tumor excision, and bacterial colony counting.

Mesurer la croissance et Gene Expression Dynamique de tumeur ciblée<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procédures d&#39;identification des prions infectieux Après passage dans le système digestif d&#39;une espèce aviaire

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Un protocole d&#39;infecter<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Avec<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

À haut débit de dosage de phénotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

génotypage des<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; par Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...