Dieser automatisierte Workflow bietet eine konsistente proteinenzymatische Verdauung mit hervorragender Reproduzierbarkeit und Durchsatz. Dies verbessert die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Biomarker-Erkennung, Validierung und klinischen Anwendung durch Massenspektrometrie. Der Vorteil dieser Technologie ist, dass der gesamte Arbeitsablauf für 96 Proben in etwa fünf Stunden mit Intra-Assay und Inter-Assay CV von weniger als 20% für die Mehrheit der Proteine abgeschlossen werden kann.
Diese genaue Probenpräparation mit hohem Durchsatz ermöglicht es uns, Krankheitsproteome von Geweben oder Biofluiden in größerem Maßstab zu untersuchen. Darüber hinaus bietet der automatisierte proteomische Probenvorbereitungsworkflow eine solide Grundlage für einen hohen Gehalt und eine quantitative proteomische Analyse. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Qin Fu, Direktor des High Throughput Center bei Cedar Sinai und Mr.Casey Johnson, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor.
Bevor Sie mit der Analyse beginnen, fügen Sie fünf Mikroliter gepooltes gesundes menschliches Plasma in eine 96 runde, tiefe Brunnenpropylenplatte ein. Wenn alle Proben geladen wurden, öffnen Sie die Software für flüssiges Handlergerät, und wählen Sie unter der Registerkarte Methode alle Achsen nach Hause aus, um den automatisierten Flüssigkeitshandler auszurichten. Vergewissern Sie sich, dass alle Workstation-Spritzen keine sichtbaren Luftblasen enthalten, öffnen Sie eine neue Methode, und klicken Sie auf Ausführen, um die Methode zu initiieren.
Geben Sie true in die Eingabe eines Werts ein, der für die Autosampler-Eingabeaufforderung verwendet werden soll, um eine Autosampler-Platte am Ende der Methode vorbereiten zu lassen, und klicken Sie auf OK. Geben Sie einen wert in die Eingabe ein, der für die eingabeaufforderung für die erste Spalte verwendet werden soll, und klicken Sie auf OK. Geben Sie 12 in die Eingabe eines Werts ein, der für die letzte Spaltenaufforderung verwendet werden soll, und klicken Sie auf OK. Wenn eine Probenplatte mit Probenvolumina von mindestens 20 Mikrolitern verwendet wird, geben Sie true in die Eingabe eines Werts ein, der für die Probenplattenaufforderung verwendet werden soll, und klicken Sie auf OK. Folgen Sie den Anweisungen im Fenster Guided Labware Setup und klicken Sie auf Fortfahren. Die entsprechenden Reagenzien in die entsprechenden Brunnen laden und auf Weiter klicken. Klicken Sie erneut auf Weiter, um das automatisierte Flüssigkeitshandlerdeck mit Reagenz-, Reaktions-, Proben- und Autosamplerplatten, sechs-gut 90 Mikroliter-Spitzenboxen, einer leeren 90-Mikroliter-Spitzenbox und einer kompletten 230-Mikroliter-Spitzenbox auszurichten.
Klicken Sie dann auf Fertig stellen, um die Methode zu beginnen. Bei der Weiterfahrt nach der Zentrifugationsaufforderung die Reaktionsplatte abrufen und in die Zentrifuge legen. Am Ende der Zentrifugation die Reaktionsplatte innerhalb des automatisierten Flüssigkeitshandlers an ihre Position zurückbringen und auf Weiter klicken.
Für die Flüssigchromatographie und Die Tandem-Massenspektrometrie-Analyse sollten die Peptide in einer C18 2,1 x 100 Millimeter 3,5 Mikrometer-Säule durch Hochstrom-Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit einer Durchflussrate von 250 Mikroliterpro Minute aufgelöst und in Zeile auf einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer analysiert werden. Gleichsetzen Sie die Säule fünf Minuten nach dem Laden mit einer 5%puffer B-Lösung aus und löschen Sie die Peptide mit einem linearen 5-35%Gradienten des Puffers B über 30 Minuten. Waschen Sie am Ende der Elution die Säule mit 98% Puffer B 10 Minuten lang, gefolgt von einer fünfminütigen Wäsche mit 5%Puffer B, bevor Sie die nächste Probe laden.
Für die Online-Umleitung verwenden Sie ein Zweiphasen-Schaltventil, um das Postkolonnen-Eluent in Abfall umzuleiten, bevor es in die Ionenquelle gelangt. Wenn alle Proben eluiert wurden, können mehrere Reaktionsüberwachungsdaten verarbeitet werden. In dieser repräsentativen Analyse wurden drei Beta-Gal-Peptide und zwei Albuminpeptide aus gespitzten Beta-Gal- und verarbeiteten Plasmaalbuminproteinen überwacht.
Die Genauigkeit des automatisierten Probenvorbereitungs-Workflows wurde als Prozentsatz des Varianzkoeffizienten des gesamten proteomischen ausgewählten Reaktionsüberwachungsworkflows abzüglich des prozentualen Varianzkoeffizienten der Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie berechnet. Wie erwartet wurden sowohl für das humane Serumalbumin als auch für Beta-Gal-Proteine gute Signalintensitäten beobachtet. Um die Präzision der Flüssigkeitsübertragungsschritte zu überwachen, können stabile isotop-markierte Peptidstandards für das endogene humane Serumalbumin und das exogene Beta-Gal-Protein in unabhängigen Reagenzübertragungsschritten gespickt werden.
Zur Validierung des automatisierten proteomischen Probenvorbereitungs-Workflows wurden die Intraday-Varianzwerte aus 21 Am selben Tag vorbereiteten Brunnen berechnet. Der durchschnittliche Intraday-Prozent-Varianzkoeffizient für 40 Proteine reichte von 4-20%Um den Kanteneffekt des plattenbasierten automatisierten Workflows zu bewerten, kann der prozentuale Varianzkoeffizient aus bestimmten Brunnen innerhalb bestimmter Spalten und Zeilen berechnet werden. In diesem repräsentativen Experiment waren die Signalintensitäten mehrerer Reaktionen in allen Spalten- und Reihenkonfigurationen ähnlich, wobei der prozentuale Varianzkoeffizient von 3-22% lag. Die wichtigsten Schritte sind das korrekte Hinzufügen einer Probe gemäß der gewünschten 96-Well-Plattenkarte und die korrekte Einrichtung der Reagenzienplatte gemäß der Anleitung der Software.
Diese automatisierte proteomische Probenvorbereitungsmethode ermöglicht es Forschern, zuverlässige und quantitative Proteomikdaten in großem Maßstab zu sammeln.
