Este flujo de trabajo automatizado proporciona una digestión enzimática de proteínas consistente con excelente reproducibilidad y rendimiento. Esto mejora la precisión y fiabilidad del descubrimiento, validación y aplicación clínica de biomarcadores por espectrometría de masas. La ventaja de esta tecnología es que todo el flujo de trabajo se puede completar para 96 muestras en aproximadamente cinco horas con CV intra-ensayo e inter-ensayo de menos del 20% para la mayoría de las proteínas.
Esta preparación precisa de muestras de alto rendimiento nos permite investigar proteomas de tejido o biofluidos de enfermedad a mayor escala. Además, el flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras proteómicas proporciona una base sólida para un alto contenido y un análisis proteómico cuantitativo. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Qin Fu, Director del Centro de Alto Rendimiento de Cedar Sinai y el Sr. Casey Johnson, un investigador asociado de mi laboratorio.
Antes de comenzar el análisis, añadir cinco microlitros de plasma humano sano agrupado en una placa redonda de propileno de pozo profundo. Una vez cargadas todas las muestras, abra el software del dispositivo de manipulación de líquidos y, en la pestaña método, seleccione el hogar de todos los ejes para orientar el controlador de líquido automatizado. Confirme que todas las jeringas de la estación de trabajo no contienen burbujas de aire visibles y abra un nuevo método y haga clic en Ejecutar para iniciar el método.
Escriba true en el valor introdúzpelo que se utilizará para que la solicitud de muestreador automático tenga una placa de muestreador automático preparada al final del método y haga clic en Aceptar. Escriba uno en la solicitud de primera columna y haga clic en Aceptar. Escriba 12 en la solicitud De la última columna y haga clic en Aceptar. Si se utiliza una placa de muestra con volúmenes de muestra de al menos 20 microlitros, introduzca true en la solicitud de placa de muestra y haga clic en Aceptar. Siga las instrucciones de la ventana Configuración de Labware guiado y haga clic en Continuar. Cargue los reactivos apropiados en los pozos adecuados y haga clic en Siguiente. Haga clic en Siguiente de nuevo para establecer la cubierta automatizada del manipulador de líquidos como se ilustra, incluyendo las placas de reactivo, reacción, muestra y autoamplor, cajas de punta de seis microlitros de 90, una caja de punta vacía de 90 microlitros y una caja de punta de 230 microlitros completa.
A continuación, haga clic en Finalizar para iniciar el método. En el indicador continuar después de la centrifugación, recupere la placa de reacción y coloque la placa en la centrífuga. Al final de la centrifugación, devuelva la placa de reacción a su posición dentro del manipulador de líquido automatizado y haga clic en Continuar.
Para el análisis de cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem, resuelva los péptidos en una columna C18 2.1 por 100 milímetros de 3,5 micrómetros mediante cromatografía líquida de alta presión de alto flujo con un caudal de 250 microlitros por minuto y analizada en línea con un espectrometro de masa triple cuadrúpedo. Cinco minutos después de la carga, equilibre la columna con una solución de 5%buffer B y eluda los péptidos con un gradiente lineal de 5-35% de buffer B durante 30 minutos. Al final de la elución, lave la columna con un 98% de búfer B durante 10 minutos seguido de un lavado de cinco minutos con un búfer B del 5% antes de cargar la siguiente muestra.
Para el desvío en línea, utilice una válvula de conmutación de dos fases para desviar el eluyente posterior a la columna al residuo antes de que entre en la fuente de iones. Cuando se han eluido todas las muestras, se pueden procesar varios datos de monitoreo de reacciones. En este análisis representativo, tres péptidos beta-gal y dos péptidos de albúmina fueron monitoreados a partir de proteínas de albúmina de plasma procesadas con picos.
La precisión del flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras se calculó como el porcentaje del coeficiente de varianza del flujo de trabajo de monitoreo de reacción seleccionado proteómico total menos el coeficiente porcentual de varianza de la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida. Como era de esperar, se observaron buenas intensidades de señal tanto para la albúmina sérica humana como para las proteínas beta-gal. Para controlar la precisión de los pasos de transferencia de líquidos, se pueden aumentar los estándares de péptidos con etiqueta de isótopo estables para la albúmina sérica humana endógena y la proteína beta-gal exógena en pasos de transferencia de reactivos independientes.
Para validar el flujo de trabajo automatizado de preparación de muestras proteómicas, el coeficiente intradía de valores de varianza se calculó a partir de 21 pozos preparados el mismo día. El coeficiente de porcentaje intradía medio de varianza para 40 proteínas osciló entre 4-20%Para evaluar el efecto de borde del flujo de trabajo automatizado basado en placas, el coeficiente porcentual de varianza se puede calcular a partir de pozos específicos dentro de columnas y filas designadas. En este experimento representativo, las intensidades de la señal de monitoreo de reacción múltiple fueron similares en todas las configuraciones de columna y fila con el coeficiente porcentual de varianza que oscila entre 3-22%Los pasos más importantes son agregar una muestra correctamente de acuerdo con el mapa de placas de 96 pozos deseado y configurar correctamente la placa de reactivo de acuerdo con las instrucciones del software.
Este método automatizado de preparación de muestras proteómicas permite a los investigadores recopilar datos proteómicos fiables y cuantitativos a gran escala.
