Bu otomatik iş akışı mükemmel tekrarlanabilirlik ve iş akışı ile tutarlı bir protein enzimatik sindirim sağlar. Bu, kütle spektrometresi ile biyomarker keşfinin, doğrulamanın ve klinik uygulamanın doğruluğunu ve güvenilirliğini artırır. Bu teknolojinin avantajı, proteinlerin çoğunluğu için %20'den daha az intra-tsay ve inter-tsay CV ile yaklaşık beş saat içinde 96 numune için tüm iş akışının tamamlanabiliyor olmasıdır.
Bu doğru yüksek iş elde numune hazırlama bize daha büyük bir ölçekte doku veya biyoakışkanların hastalık proteomları araştırmak için izin. Buna ek olarak, otomatik proteomik numune hazırlama iş akışı yüksek içerik ve nicel proteomik analiz için sağlam bir temel sağlar. Prosedürü gösteren Dr Qin Fu, Cedar Sinai Yüksek Throughput Merkezi Müdürü ve Bay Casey Johnson, benim laboratuvar bir araştırma görevlisi olacaktır.
Analize başlamadan önce, 96 yuvarlak derin ve iyi propilen plaka içine havuzlu sağlıklı insan plazması beş mikrolitre ekleyin. Tüm örnekler yüklendiğinde, sıvı işleyici cihaz yazılımını açın ve yöntem sekmesi altında, otomatik sıvı işleyicisini yönlendirmek için tüm eksenleri seçin. Tüm iş istasyonu şırıngalarının görünür hava kabarcıkları içermediğini onaylayın ve yeni bir yöntem açın ve yöntemi başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın.
Yöntemin sonunda bir autosampler plakası hazırlatmak için otomatik örnekleyici istemi için kullanılacak bir değer girin ve Tamam'ı tıklatın. İlk sütun istemi için kullanılacak bir değer girin ve Tamam'ı tıklatın. Son sütun istemi için kullanılacak bir değer girin ve Tamam'ı tıklatın. Örnek plaka en az 20 mikrolitre lik numune hacimleri ile kullanılıyorsa, örnek plaka istemi için kullanılacak bir değer girin ve Tamam'ı tıklatın. Kılavuzlu Labware Kurulumu penceresindeki yönergeleri izleyin ve Devam'ı tıklatın. Uygun reaktifleri uygun kuyulara yükleyin ve İleri'yi tıklatın. Reaktif, reaksiyon, numune ve otomatik numune ölçer plakaları, altı kuyulu 90 mikrolitre uç kutuları, boş 90 mikrolitre lik uç kutusu ve tam 230 mikrolitrelik uç kutusu dahil olmak üzere gösterildiği gibi otomatik sıvı işleyici destesini yeniden düzenlemek için İleri'yi tıklatın.
Ardından yönteme başlamak için Bitir'i tıklatın. Santrifüj isteminden sonra devam edin, reaksiyon plakasını alın ve plakayı santrifüjün içine yerleştirin. Santrifüjün sonunda, reaksiyon plakasını otomatik sıvı işleyicisi içindeki konumuna döndürün ve Continue'yi tıklatın.
Sıvı kromatografi spektrografi ve tandem kütle spektrometresi analizi için, c18 2.1 ile 100 milimetre 3,5 mikrometre likit kolondaki peptidleri dakikada 250 mikrolitre akış hızıile yüksek akışlı yüksek basınçlı sıvı kromatografi ile çözün ve üçlü dörtkutuplu kütle spektrometresi üzerinde sırayla analiz edin. Yüklemeden beş dakika sonra, kolon %5 tampon B çözeltisi ile dengeleyin ve 30 dakika boyunca doğrusal 5-35% tampon B degradesi ile peptidleri equilibrate. Elüsyonun sonunda, bir sonraki numuneyi yüklemeden önce kolonda 10 dakika boyunca %98 arabellek B ile yıkayın ve ardından %5 arabellek B ile beş dakikalık bir yıkama.
Çevrimiçi saptırma için, iyon kaynağına girmeden önce kolon sonrası eluent'i atık olarak aktarmak için iki fazlı bir anahtarlama valfi kullanın. Örneklerin tümü eluted olduğunda, birden çok tepki izleme verileri işlenebilir. Bu temsili analizde, sivri beta-gal ve işlenmiş plazma albumin proteinlerinden üç beta-gal peptid ve iki albümin peptid izlendi.
Otomatik numune hazırlama iş akışının hassasiyeti, toplam proteomik seçilmiş reaksiyon izleme iş akışının varyans katsayısının yüzdesi eksi sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresinin varyans yüzdesi olarak hesaplanmıştır. Beklendiği gibi, iyi sinyal yoğunlukları hem insan serum albumin ve beta-gal proteinleriçin gözlendi. Sıvı transfer adımlarının hassasiyetini izlemek için, endojen insan serum albumini ve bağımsız reaktif transfer basamaklarında eksojen beta-gal proteini için kararlı izotop etiketli peptit standartları yükselilebilir.
Otomatik proteomik numune hazırlama iş akışını doğrulamak için, gün içi varyans değerleri katsayısı aynı gün içinde hazırlanan 21 kuyudan hesaplanmıştır. 40 protein için ortalama gün içi yüzde varyans katsayısı %4-20 arasında değişmekte olup, plaka bazlı otomatik iş akışının kenar etkisini değerlendirmek için, belirlenen sütun ve satırlar içindeki belirli kuyulardan yüzde varyans katsayısı hesaplanabilir. Bu temsili deneyde, çoklu reaksiyon izleme sinyali yoğunlukları tüm kolon ve satır konfigürasyonlarında %3-22 arasında değişen varyans katsayısı ile benzerdi En önemli adımlar, istenilen 96 kuyulu plaka haritasına göre bir numuneyi doğru bir şekilde eklemek ve reaktif plakasını yazılım talimatına göre doğru bir şekilde kurmaktır.
Bu otomatik proteomik numune hazırlama yöntemi, araştırmacıların büyük ölçekte güvenilir ve nicel proteomik veriler toplamasına olanak tanır.
