이 자동화된 워크플로우는 우수한 재현성과 처리량을 갖춘 일관된 단백질 효소 소화를 제공합니다. 이를 통해 대량 분광법에 의한 바이오마커 발견, 검증 및 임상 적용의 정확성과 신뢰성을 향상시킵니다. 이 기술의 장점은 전체 워크플로우가 단백질의 대다수에 대해 20% 미만의 인트라 분석 및 분석 간 CV를 사용하여 약 5시간 안에 96개의 샘플에 대해 완료될 수 있다는 것입니다.
이 정확한 높은 처리량 샘플 준비를 통해 조직 또는 생물 유체의 질병 프로템을 더 큰 규모로 조사할 수 있습니다. 또한, 자동화된 프로테오믹 샘플 준비 워크플로우는 고함량 및 정량적 프로테오믹 분석을 위한 견고한 기초를 제공합니다. 시더 시나이의 고처리량 센터 장과 실험실의 연구 동료인 케이시 존슨(Casey Johnson) 박사가 수술을 시연합니다.
분석을 시작하기 전에 풀이 잡힌 건강한 인간 플라즈마 5마이크로리터를 96라운드 딥 웰 프로필렌 플레이트에 넣습니다. 모든 샘플이 로드되면 액체 처리기 장치 소프트웨어를 열고 메서드 탭 아래에 모든 축을 선택하여 자동화된 액체 처리기를 방향을 지정합니다. 모든 워크스테이션 주사기에 보이는 기포가 포함되어 있지 않은지 확인하고 새 메서드를 열고 Run을 클릭하여 메서드를 시작합니다.
자동 샘플러 프롬프트에 사용할 값을 입력하여 방법 끝에 자동 샘플러 플레이트를 준비하고 확인을 클릭합니다. 첫 번째 열 프롬프트에 사용할 값을 입력하고 확인을 클릭합니다. 마지막 열 프롬프트에 사용할 값을 입력할 때 12를 입력하고 확인을 클릭합니다. 샘플 플레이트가 최소 20마이크로리터의 샘플 볼륨과 함께 사용되는 경우 샘플 플레이트 프롬프트에 사용할 값을 입력하여 확인을 클릭합니다. 안내 랩웨어 설정 창의 방향을 따라 계속을 클릭합니다. 적절한 시약을 적절한 우물에 로드하고 다음을 클릭합니다. 시약, 반응, 샘플 및 자동 샘플러 플레이트, 6웰 90 마이크로 리터 팁 박스, 빈 90 마이크로 리터 팁 박스 및 전체 230 마이크로 리터 팁 상자를 포함하여 그림과 같이 자동화 된 액체 처리기 데크를 배치하려면 다음을 다시 클릭하십시오.
그런 다음 작업을 시작하려면 마무리를 클릭합니다. 원심분리 프롬프트 후 계속되면 반응판을 회수하고 플레이트를 원심분리기에 넣습니다. 원심 분리가 끝나면 반응 판을 자동화된 액체 처리기 내의 위치로 반환하고 계속을 클릭합니다.
액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분광법 해석의 경우, 분당 250 마이크로리터의 유속을 가진 고압 액체 크로마토그래피에 의해 C18 2.1에서 100 밀리미터 3.5 마이크로미터 컬럼으로 펩티드를 해결하고 삼중 사중극 질량 분광계에서 라인으로 분석하였다. 적재 후 5분 후, 5%버퍼 B 용액으로 컬럼을 평형화하고 30분 동안 완충 B의 선형 5-35%그라데이션으로 펩티드를 엘테한다. 용출의 끝에서, 다음 샘플을로드하기 전에 5 %의 버퍼 B로 5 분 세척 후 10 분 동안 98 %의 버퍼 B로 컬럼을 세척합니다.
온라인 전환의 경우 2단계 스위칭 밸브를 사용하여 이온 소스에 들어가기 전에 열 후 용희석을 낭비하도록 전환합니다. 모든 샘플을 발출하면 다중 반응 모니터링 데이터를 처리할 수 있습니다. 본 대표적인 분석에서, 3개의 베타-갈 펩티드와 2개의 알부민 펩타이드는 스파이크 베타-갈및 가공된 플라즈마 알부민 단백질로부터 감시되었다.
자동화된 샘플 준비 워크플로우의 정밀도는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법의 분산계수를 뺀 총 프로테오믹 선택된 반응 모니터링 워크플로우의 분산 계수의 백분율로 계산되었다. 예상대로, 인간 혈청 알부민과 베타 갈 단백질 모두에 대해 양호한 신호 강도가 관찰되었다. 액체 전달 단계의 정밀도를 모니터링하기 위해, 독립적인 시약 전달 단계에서 내인성 인간 혈청 알부민 및 외인성 베타 갈 단백질에 대해 안정적인 동위원소 라벨 펩티드 표준을 스파이크할 수 있다.
자동화된 프로테오믹 샘플 준비 워크플로우의 유효성을 검사하기 위해 동일한 날 준비된 21개의 우물에서 분산 값의 장중 계수를 계산했습니다. 40단백질에 대한 평균 장중 분산계는 4~20%까지 플레이트 기반 자동화 워크플로우의 에지 효과를 평가하기 위해 지정된 컬럼 및 행 내의 특정 우물에서 분산의 백분율 계수를 계산할 수 있습니다. 본 대표적인 실험에서, 다중 반응 모니터링 신호 강도는 3-22%에 이르는 분산계수의 퍼센트계수를 가진 모든 컬럼 및 행 구성에서 유사했으며 가장 중요한 단계는 원하는 96웰 플레이트 맵에 따라 샘플을 올바르게 추가하고 소프트웨어에 의한 지시에 따라 시약 플레이트를 올바르게 설정하는 것이다.
이 자동화된 프로테오믹 샘플 준비 방법을 통해 연구자들은 신뢰할 수 있고 정량적인 프로테오믹스 데이터를 대규모로 수집할 수 있습니다.
