MA a été soutenue par une bourse de Schrödinger du Fonds scientifique autrichien (FWF, J3086-B11) et remercie la Max-Planck-Society for soutien financier et administratif. GS et JH ont été soutenus par le Fonds Science et technologie de Vienne (WWTF, LS13-030).

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interest.

Mesure interactions protéine-protéine in situ est très souhaitable en particulier lorsque le traitement avec des interactions de faible affinité tels que TCR-pMHC de liaison 11. Ceci parce que le taux ainsi que sur la stabilité de ces interactions sont fortement influencés par les circonstances particulières dans lesquelles la liaison a lieu. Des approches d&#39;imagerie à base de FRET mini-invasives sont donc en principe parfaitement adapté pour de telles tâches, mais impliquent un certain nombre d&#39;obstacles qui doivent d&#39;abord être surmontés. Le bruit généré par autofluorescence cellulaire limite la sensibilité des mesures et doit donc être maintenu à un minimum. Microscopie FRBR sert ce besoin très bien 12 mais nécessite la fonctionnalisation de verre-diapositives, idéalement sous la forme d&#39;un plan de verre soutenue bicouche lipidique décorée avec des protéines de choix 13-15. Un autre avantage d&#39;une approche en partie reconstitutive est que les partenaires de FRET bicouches-résident recombinants peuvent être beaucoup mle minerai facilement marqué dans un, spécifique au site de manière rationnelle et quantitative avec des fluorophores plus petits et plus lumineux que ce qui serait possible avec des protéines exprimées à la surface des cellules. TCR sont étiquetés avec SCF recombinant V s, qui ne sont pas d&#39;influence sur la reconnaissance des cellules T, comme cela a été précédemment testé deux. En outre, la composition protéique de la SLB, par exemple la densité de pMHCs et le choix des éléments accessoires peut être ajustée à ses besoins spécifiques. Nous avons déjà réalisé des expériences avec des densités de pMHCs stimulateurs varier, mais avons pas détecté de différences significatives en 2D-k off et 2D-K D 2. Jusqu&#39;à présent, ici la reconnaissance des molécules du CMH de classe II a été traitée avec seulement, principalement en raison de la nature de leur fente de liaison peptidique, qui est ouvert aux deux extrémités et reçoit donc des peptides plus grands, y compris un agent de liaison pour la fixation de fluorophore. Dans certains cas, cette approche pourrait également travailler pour l&#39;étiquetage CMH class je molécules 16, mais une grande prudence devraient être prises pour vérifier leur utilisation dans des expériences. La sensibilité des cellules T à l&#39;égard des antigènes, qui peuvent être mesurés par des tests de prolifération des cellules T, ainsi que la cinétique de liaison pMHC-TCR telle que mesurée in vitro par résonance plasmonique de surface ne doit pas être affectée par l&#39;addition de l&#39;agent de liaison et un fluorophore à le peptide. Alternativement, CMH de classe I se molécules peuvent être étiqueté d&#39;une manière spécifique au site avec l&#39;introduction d&#39;une cystéine non apparié dans la séquence de la chaîne lourde (observations non publiées). Avec l&#39;utilisation de sondes moléculaires appropriés toute interaction protéine-protéine synaptique peut en principe être étudié de façon que décrit ici. Ces sondes, par exemple, le SCF V s ou des protéines Conçu Ankyrin de répétition (DARPins) 17, devraient être monovalent et doivent lier leur cible de manière stable sans affecter l&#39;interaction d&#39;intérêt. Bien sûr, informatio structurellen est hautement souhaitable pour la conception de la sonde rationnelle mais pas absolument nécessaire. Lors de l&#39;établissement d&#39;une nouvelle paire de partenaires de FRET, il est recommandé d&#39;enregistrer et d&#39;analyser FRET en vrac premier. Les sites d&#39;attachement de l&#39;étiquette peuvent varier considérablement à maximiser le signal de FRET et aussi pour vérifier que les rendements mesurés FRET diffèrent en fonction de la distance inter-colorant. Une fois que le système est optimisé, seule molécule FRET signaux peuvent être enregistrés en limitant l&#39;étiquetage de la forte abondance FRET partenaire à 10-30% et de blanchiment de la faible abondance FRET partenaire jusqu&#39;à molécules simples peuvent être résolus dans le domaine de l&#39;éclairage. Last but not least, il convient de noter que SLBS rapprochant certains, mais pas tous les aspects d&#39;une membrane plasmique physiologique. Des qualités telles que la courbure de la membrane et la flexibilité, domaine cloisonnement, réarrangements du cytosquelette et la motilité cellulaire ainsi que d&#39;une grande variété de protéines membranaires exprimées en surface ne sont pas représentés par SLBS mais pourraient influencer til traiter sous enquête. Beaucoup d&#39;efforts devront être investis pour établir des modalités d&#39;imagerie qui permettent la surveillance interactions protéine-protéine avec une résolution de la molécule unique dans les synapses physiologiques, qui sont inaccessibles à l&#39;imagerie de la FRBR.

Une compréhension plus fondamentale de la façon dont les cellules T reconnaissent les antigènes, il faut regarder au bon endroit, qui est, au sein de la synapse immunologique formé entre la cellule T et l&#39;APC. Ici, la cinétique de liaison moléculaires ne sont pas seulement déterminées par les propriétés biochimiques intrinsèques des partenaires d&#39;interaction en cause, mais dépend dans une large mesure, de paramètres cellulaires qui comprennent des forces cellulaires, l&#39;architecture de la membrane et des interactions latérales entre protéines membranaires ainsi que les contraintes géométriques spécifiques synapse 3. Approches biochimiques sont limités en puissance de résolution car ils nécessitent l&#39;interruption d&#39;au moins une des membranes synaptiques concernées. Pour cette raison, une méthode d&#39;imagerie basée FRET a été développé pour surveiller la liaison du TCR à pMHCs antigéniques 2. Voici cellules T sont décorées avec un recombinant et site spécifiquement étiquetés TCRβ-réactive chaîne unique fragment d&#39;anticorps (SCF V) et confrontés avec le plan<html> ar bicouches lipidiques verre soutenu (SLBS), qui abritent des molécules du CMH de classe II chargées avec un peptide antigénique marqué par fluorescence, les molécules de co-stimulation et des protéines d&#39;adhésion. Synaptic liaison entre les résultats pMHC marqués par un colorant TCR et marqué par un colorant dans FRET, qui peuvent être surveillés sur un vrac et le niveau de la molécule unique par fluorescence à réflexion interne totale (FRBR) microscopie. Dans cet article, il est expliqué en détail comment utiliser SLBS pour doser synapses des cellules T, vérifier leur intégrité à travers un dosage de calcium-flux T-cellule fonctionnelle, la conduite de FRET mesures en vrac et à la sensibilité de la molécule unique, et d&#39;analyser les données acquises. Recommandations sont offerts à la production de protéines correctement conformés requises pour bicouche fonctionnalisation. Pour des informations plus spécifiques concernant la formation de bicouche et la configuration d&#39;un microscope de la FRBR appropriée s&#39;il vous plaît se référer à un accès public publication JoVE supplémentaire publiée dos à dos 4. tente &quot;&gt; Nature de SLBS SLBS fonctionnalisables peuvent être facilement générés à partir de vésicules unilamellaires (SUV) contenant les deux lipides-2-oléoyl-sn-gylcero-3-phosphocholine 1-palmitoyl (courte: POPC, 90-99%) et 1,2 sn-dioleoyl- - glycéro-3 - {[N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique acide] succinyl} (courte: DGS NTA-Ni, 1-10%). VUS étalées sur des lames de verre propres pour former une bicouche plane contiguë 4. DGS-NTA-Ni sert à ancrer les protéines à marquage polyhistidine via la formation de complexe-polyhistidine médiée par la synthèse NTA-Ni contenant un groupe de tête (figure 1A). Pour association stable, on le remplace généralement le domaine transmembranaire natif et la queue cytoplasmique de la protéine d&#39;adhésion ICAM-1 et la molécule de co-stimulation B7-1 avec une étiquette contenant douze histidines (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (figure 1B) . Le peptide-molécule de classe II chargé IE k contient deux chaînes de polypeptide membranaire incorporé (α et β)s. Les transmembranaires / domaines cytoplasmiques de deux chaînes doivent être remplacés avec une étiquette contenant six histidines chaque (IE k α β 6H 6H ou IE k -2x6H). En variante, l&#39;extension de la chaîne α-douze histidines et en laissant le domaine extracellulaire de la chaîne β-non marqué (donnant lieu à des α k IE 0H 12H β ou IE -12H k) donne lieu à des résultats satisfaisants (figure 1B). Étiquetage des pMHCs spécifique au site Il est important de marquer le pMHC stoechiométriquement et spécifique au site afin d&#39;être en mesure de convertir mesurées FRET rendements dans des constantes de liaison d&#39;équilibre significatives. Ceci peut être réalisé par marquage chimique d&#39;un peptide synthétique qui est chargé dans la fente de l&#39;histidine recombinante étiquetée du CMH de classe II de 2,5 molécules de liaison peptidique. Le peptide comprend tous les résidus de l&#39;épitope de cellule T comme well comme un C-terminal de liaison courte (GGS), suivie par la cystéine (par exemple dans la teigne du cytochrome c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GGSC, le linker est marquée en gras). Cette cystéine est utilisé pour marquer le peptide stoechiométriquement avec l&#39;utilisation de dérivés de maléimide colorant. À ce stade soin supplémentaire devrait être consacrée à la vérification quantitative colorant couplage au peptide contenant de la cystéine. HPLC-purification du produit d&#39;addition de peptide-colorant est recommandé et doit être suivie par spectroscopie de masse à ionisation électrospray. Toute masses enregistrées correspondant au produit de départ de peptide (sans colorant) reflètent l&#39;étiquetage incomplet. Si cela est vrai, le peptide purifié par HPLC doit être soumis à des cycles de colorant étiquetage consécutifs jusqu&#39;à ce que l&#39;étiquetage est considéré quantitative. A noter que la spectroscopie de masse MALDI-TOF doit être évitée car ce procédé implique un rayonnement laser pour l&#39;ionisation échantillon. Ce traitement se désintègre les fluorophores sensibles attachés avant la messe de peptide est lue et donc underrepre<html> sente degrés de colorant conjugaison. Marquage indirect instant spécifique de site de cellules TCR lié à l&#39;utilisation de fragments monovalents à chaîne unique Fv Il est encore difficile de fixer des colorants à la cellule des protéines des cellules vivantes surface associée d&#39;une manière spécifique au site. Pour surmonter cet obstacle pour les TCR de surface exposé, une version monovalent à chaîne unique (scFv V) à partir des gènes de l&#39;anticorps monoclonal TCRβ -reactive H57-197 2 a été construit. La structure cristalline de cet anticorps dans un complexe avec le TCR permet de concevoir rationnellement une version, dans lequel un résidu de serine à proximité immédiate de l&#39;extrémité C-terminale du peptide associé au CMH (lorsque le partenaire colorant FRET correspondant est attaché) est remplacé par un résidu cystéine. Ce mutant cysteine ​​sert alors d&#39;accepteur de colorant pour la conjugaison (figure 2). Méthodologies d&#39;enregistrer FRET nt &quot;&gt; Les valeurs de FRET en vrac sont les mieux adaptés à vérifier la relation entre les distances inter-colorants choisis et FRET efficacité mesurés dans cette TCR-pMHC système de liaison 2. En outre, les mesures de FRET en vrac révèlent des différences qualitatives et quantitatives dans synaptiques affinités TCR-pMHC ( voir ci-dessous et la section de protocole 3.2). Différentes approches pour quantifier l&#39;efficacité de FRET ont été introduites dans la littérature 6. Dans cet article FRET est enregistrée via (a) la récupération de donneur après accepteur blanchiment, et via (b) sensibilisé FRET accepteur émission. Le premier procédé (a) nécessite l&#39;utilisation d&#39;un accepteur de FRET qui peut être facilement décolorées, et d&#39;un donneur, qui est plutôt photostable. En outre, il est important de veiller à ce que l&#39;accepteur décolorées est plus capable d&#39;éteindre la fluorescence du donneur. Comme le même canal de détection (donneur) est utilisée pour la quantification, un pas de facteurs de correctiond aucun aberrations chromatiques doivent être considérées, ce qui rend cette simple méthodologie et fiable. Cependant, les mesures quantitatives ne peuvent pas être répétées au même endroit de l&#39;échantillon et les changements de FRET ne peuvent pas être enregistrées au fil du temps. Pour éviter les effets causés par la diffusion moléculaire ou la motilité cellulaire une étape de blanchiment rapide doit être recherché, ce qui minimise le temps qui passe entre le premier donneur de FRET (avant accepteur blanchiment) et la seconde image acquisition FRET donneur (après FRET accepteur blanchiment). Il est recommandé d&#39;utiliser une source de lumière laser puissant du FRET accepteur d&#39;onde d&#39;excitation afin de minimiser éclairage et de blanchiment fois. En revanche, dans l&#39;approche de la mesure de FRET de l&#39;émission sensibilisée (b) le donneur FRET est excité et l&#39;émission de l&#39;accepteur de FRET est observé dans le canal d&#39;accepteur FRET. Changements dans signal d&#39;accepteur FRET peuvent être enregistrées au fil du temps, mais émission du donneur FRET dans le canal accepteur décalée vers le rouge (termed bleedthrough) et accepteur FRET croix-excitation via donateurs excitation doit être déterminé et soustrait du canal accepteur FRET correctement enregistrée. Pour cela, les images d&#39;accepteur FRET FRET donneur correspondant et doivent être alignés spatialement. Détection de molécule unique (sm) FRET événements Avec l&#39;utilisation des lasers en tant que source d&#39;excitation, et une caméra sensible microscopie TIRF de bruit atténué la fluorescence de fluorophores simples peuvent être facilement tracé au fil du temps. Similaire est vrai pour la détection d&#39;événements de smFRET intermoléculaires. Toutefois, des complications peuvent être causés par FRET bleedthrough des bailleurs de fonds et de contre-excitation de l&#39;accepteur de FRET, et donc le plus grand soin doit être pris lors de l&#39;ajustement des densités de fluorophores dans l&#39;expérience smFRET. Dans le protocole ci-dessous (section 4 du protocole) du TCR a été choisi comme donneur de FRET en haute abondance et pMHC comme accepteur FRET en faible abondance. Pour atténuer FRET donateurs bleedthrough suffisamment, décorer 10-30% des TCR avec fluorescente scF V et 90-70% des TCR avec des non-fluorescente scF V. Voici le canal accepteur FRET a été choisi comme canal de la molécule unique, car il est confocale avec le seule molécule FRET canal. Cela permet d&#39;aligner événements smFRET avec une seule molécule FRET accepteurs, qui est la base de la validation smFRET. Extraction hors-taux synaptiques par des mesures smFRET Photoblanchiment des deux FRET donneur et accepteur FRET doivent être pris en compte lors de l&#39;extraction de la demi-vie des interactions de molécule unique FRET traces. Le nombre de FRET signaux observables au début de leur apparition en tant que seule paire donneur-accepteur N (0) est réduite au fil du temps à la fois par la déliaison du photoblanchiment complexe et récepteur-ligand. Le nombre de survivants complexes à un moment donné N (t) peut être exprimée mathématiquement comme suit: Dans le terme exp de photoblanchiment (-t / τ de blanchiment), le temps t est décrit par le produit du nombre d&#39;observations n et l&#39;illumination temps t mauvais à cause du mode d&#39;observation non continue, discrets (par exemple, la décoloration ne se produit que pendant l&#39;illumination ). Dans le EXP- cinétique à long terme (t / τ off) le temps t est le produit du nombre d&#39;observations n et t le temps de retard pour une seule observation de FRET (c.-à-déliaison cinétique se produit en continu). L&#39;équation 1 peut être exprimée comme: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Le terme τ eau de Javel / τ des maladescribes le nombre d&#39;observations jusqu&#39;au blanchissement se produit et est défini comme la valeur moyenne &lt;n blanchir&gt; de sa fonction exponentielle. L&#39;équation 2 peut être simplifiée comme suit: <img alt="Équation 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> La valeur moyenne &lt;n (t lag)&gt; du nombre d&#39;images N (t) avec FRET événements observables après l&#39;instant t est déterminé directement à partir de l&#39;expérience. Il dépend du temps réglable entre les observations (T lag) choisis dans l&#39;expérience et les valeurs inconnues pour τ off (l&#39;inverse de la vitesse de dissociation k off) et &lt;n blanchir&gt;, la valeur moyenne du nombre d&#39;observations avant le blanchiment se produit . Ainsi, le calcul de la valeur moyenne &lt;n (t de latence)&gt; pendant au moins deux valeurs de t <sub&gt; décalage permet la détermination expérimentale de &lt;n blanchir&gt; et T pour off. L&#39;extraction de valeurs synaptiques 2D-K D par des mesures sur la base de FRET- Mesure TCR occupation d&#39;un, à savoir le rapport entre le TCR et TCR consolidés totaux, est essentiel pour la détermination des valeurs synaptiques 2D-K D. Selon l&#39;équation 4 ce terme est directement proportionnelle à la mesure FRET céder tant que TCR sert donateurs et pMHCs comme accepteurs FRET FRET. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> avec une occupation = TCR, C = facteur de conversion C est une constante qui dépend du système de FRET et les fluorophores utilisés. Il peut être déterminé expérimentalement, comme indiqué ci-dessous. un peut être converti en un 2D-K D conformément à l&#39;équation 5 lorsque ledensité initiale de ligands de TCR avant l&#39;addition des cellules T à la bicouche est connue. Ceci est dû à la forte mobilité des protéines SLB-jointes et aussi parce que SLBS fournir un réservoir presque inépuisable de ligands 2. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> avec [initial pMHC] = densité initiale de pMHC avant l&#39;addition des cellules T Avec équations 4 et 5, on peut maintenant facilement déterminer la synaptique 2D-K D entre TCR et pMHC. Ceci est le plus fiable fait avec des mesures de FRET à base de récupération de donneur après accepteur blanchiment (voir la section de protocole 3.1). Cependant, pour mesurer C la relation entre l&#39;intensité de FRET je FRET (corrigé pour le fond, FRET bleedthrough donneur et accepteur FRET croix-excitation) et TCR occupation A doit être déterminée. Pour cela, unea besoin de connaître le rapport R entre l&#39;intensité de fluorescence moyenne de fluorophores simples TCR-associés FRET donateurs (par exemple Cy3 ou AF555) sm je donneur de FRET et l&#39;intensité moyenne de la molécule unique FRET événements sm i FRET. R dépend du système de FRET en question, les filtres d&#39;émission et de la caméra utilisée pour la détection de fluorescence. Le TCR OCCUPATION un peut alors être directement déterminé selon l&#39;équation 6. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> avec R = sm je donneur de FRET / sm je FRET R a été déterminée comme 1,45 pour le système H57 scFv Cy3 / Cy5-pMHC conduit à: a = vrac je FRET / vrac je TCR-cy3 • 1,45 La relation entre le taux d&#39;occupation des TCR a et le rendement de FRET peut être déterminée par FRET donneur récupérery accepteur après blanchiment. Pour ces deux paramètres sont tracés les uns contre les autres pour un certain nombre de TCR microamas comme représenté sur la figure 4A .La pente de la régression linéaire indique le facteur de conversion C (à partir de l&#39;équation 4). Comme le montre la figure 4A, C représente pour (a) le scFv V H57 - Cy3 / Cy5-pMHC système FRET et (b) la configuration du système de microscope appliqué à 1,995. Le TCR occupation d&#39;un peut être facilement déduit comme suit: Occupation du TCR a = FRET céder • 1.995

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

L&#39;enregistrement du calcium intracellulaire via le colorant de calcium fura-2, ainsi que l&#39;analyse cellulaire ultérieure pour vérifier l&#39;activité de stimulation et donc la fonctionnalité de SLBS sont représentés sur la figure 4. Comme devient évident, les taux de calcium augmente dans les lymphocytes T (exprimée en normalisée Fura-2 340nm / 380nm rapport aux valeurs de base étant 1) immédiatement dès qu&#39;ils installent sur les SLBS stimulatrices. Les taux de calcium retournent aux niveaux de référence peu de temps après l&#39;addition d&#39;un anticorps qui bloque pMHCs engagement du TCR et qui se termine activation des lymphocytes T. La figure 6 représente une expérience typique impliquant FRET donneur de récupération après accepteur blanchiment, qui est utilisé pour mesurer les rendements de FRET et qui sert à calculer les valeurs 2D-K D (représentée sur la figure 4). S&#39;il vous plaît noter l&#39;augmentation de l&#39;intensité des donateurs FRET, qui représente TCR marqué par AF555, après l&#39;ablation rapide et complète de l&#39;un FRETespèces cceptor (ici: AF647 associé à pMHCs). De plus évident est la réduction solide dans le canal de FRET, à savoir le canal accepteur FRET FRET donneur sous excitation, après accepteur FRET blanchiment. Le signal restant à peine visible correspond à donneur de FRET bleedthrough. Rendements FRET dans TCR microamas individuels ou synapses entières sont calculés sur la base des valeurs indiquées d&#39;intensité mesurées (figure 6B). La figure 7 illustre une trajectoire et laps de temps d&#39;une seule molécule événement FRET visible dans deux cadres temporels. Comme indiqué ci-dessus dans l&#39;introduction de tels comportements est causée à la fois par la décomposition des synaptique TCR-pMHC contraignant et photoblanchiment. Pour la distinction entre ces deux contributions, les expérimentaux délais d&#39;acquisition doivent être varié dans la durée: tout photoblanchiment reste une constante, les changements dans FRET longueur événement de trajectoire ne sont causées par la cinétique de liaison. Une quantification de tracelengths, w<html> UEL constitue la base pour le calcul des taux et des effluents de blanchiment représentés sur la figure 7, sont fournis dans les tableaux 1 à 3. Détermination de la 2D-K D s nécessite l&#39;enregistrement de gros rendements pour FRET FRET donateurs TCR étiquetés. Avec l&#39;utilisation de la constante C expérimentalement déduite (figure 4), avec un rendement de FRET mesuré pour une Microcluster de TCR ou toute une synapse peut être converti en le TCR occupation a, à savoir, le rapport de TCR pMHC-activité et totales (Figure 4C) . Avec des densités pMHC connus présents sur le SLB avant l&#39;addition de la cellule T, une des valeurs peuvent être appliquées pour déterminer les valeurs K synaptiques 2D-D (Figure 4D). Sur les taux peuvent être calculés avec la loi d&#39;action de masse (2D-K = 2D-k off / 2D-K D) de la synaptique déterminée hors taux et les valeurs 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Représentation schématique du système plane de verre supportée bicouche lipidique (SLB). (A) sont composés de SLBS POPC (90-99%) et le lipide synthétique DGS Ni-NTA (1-10%) et forment spontanément lorsque les surfaces de verre propres sont chargés de petites vésicules unilamellaires (SUV) constitué par les lipides correspondants. (B) Une fois formé, ces SLBS peuvent être fonctionnalisés avec des parties solubles dans l&#39;polyhistidine marqués extracellulaires dérivées de co-stimulation B7-1, pMHCs protéines ICAM-1 et des protéines d&#39;adhésion, pour servir de CPA pour les cellules T. Pour plus d&#39;informations sur la préparation SLBS référer à Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Förster Resonance Energy basée sur le transfert de dosage pour quantifier la liaison TCR-pMHC in situ. (A) une structure composite d&#39;un TCR complexé avec un fragment à chaîne unique H57 engager un pMHC illustre l&#39;approche FRET décrit ici. Notez la courte distance d&#39;environ 41a séparant les deux fluorophores correspondants subissant FRET. Sites accepteurs de fluorophores-maléimides sont indiqués en vert et rouge. (B) Le principe de la détection des interactions TCR-pMHC in situ est illustré. Seulement scF V -decorated TCR et pMHCs (ici IE k), qui forment des complexes spécifiques, donner lieu à un signal de FRET mesurable. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> &quot;/&gt; Figure 3. Les chromatogrammes de la dernière montée étape de filtration sur gel donnant de monomères scFv V s et un peptide chargé IE k -2x6H molécules. Axes X représentent volume de rétention en ml axes Y indiquent l&#39;absorbance à 280 nm en unités arbitraires (AU) . (A) H57 V scFv spécifique de site marqué avec Alexa Fluor 555 maléimide a été soumis à une Chromatographie pour séparer S75 colorant qui n&#39;a pas réagi à partir de la protéine (étape 1.2.5). Les fractions correspondant à l&#39;intervalle de rétention 14 to15 ml (lignes pointillées) représentent étiquetés monomère H57 scF V. (B), à savoir k molécules d&#39;-2x6H complexés avec l&#39;ANP espace titulaire peptide clivable-UV avait été irradiée aux rayons UV, incubées avec site spécifiquement Alex 647 maléimide peptide marqué et finalement soumis à une chromatographie pour séparer le S200 protéine de peptide libre (étape 1.1.2.4). L&#39;intervalle entre les lignes pointillées contient correctement pliés et pMHCs monomères. (A, B) </strong&gt; 0,7 ml échantillon a été appliqué à la colonne au début du rhum (0 ml point). Fractions recueillies ont été concentrées. Le rapport protéine à colorant a été déterminée par photospectrometry avant la dialyse contre PBS / glycérol à 50% (pour le stockage à -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figure 4. Déterminer 2D-K D s et 2D-k sur l&#39;art. (A) La corrélation entre le rendement de FRET tel que déterminé par la reprise de donneur après accepteur blanchiment et l&#39;occupation TCR a été mesurée expérimentalement. Occupation TCR peut être déterminée pour TCR microamas individuels comme expliqué dans la section 4.2. Un ajustement linéaire des données est indiqué par la ligne, dont la pente est égale au rapport entre C TCRoccupation et le rendement de FRET. C est une constante spécifique pour le système de FRET et les fluorophores (ici Cy3 et Cy5) employés. Dans cet exemple, il a abouti à 1.988. (B) FRET données de rendement ont été déterminées pour TCR microamas individuels (N = 187, la température = 24 ° C) grâce à la récupération des bailleurs de fonds d&#39;accepteur blanchiment. Numéros ci-dessous barres de l&#39;histogramme indiquent la limite supérieure dans l&#39;intervalle. (C) Conversion des données présentées dans (B) en multipliant mesurée FRET rendements avec la constante C déterminée (A). Les nombres ci-dessous barres indiquent la limite supérieure dans l&#39;intervalle. (D) de l&#39;histogramme (semi-logarithmique, base = 4) représentant la distribution de 2D-K D s, mesurée à microamas TCR individuels. La médiane 2D-K D est indiqué en bleu. Les nombres ci-dessous barres indiquent la limite supérieure dans l&#39;intervalle. (E) L&#39;histogramme représenté en (D) a été converti intoa 2D-k sur -histogram (semi-logarithmique, base = 4) employant le k synaptique off pour 24 ° C (0,41 s -1). La 2D-k médian déterminé sur la valeur est indiquée en bleu. Les données ont été initialement publiés dans Huppa et al. 2 et sont visualisés ici dans un nouveau format. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figure 5. validation fonctionnelle de SLBS employé pour la stimulation des cellules T et d&#39;imagerie. (A) TCR transgéniques blastes de cellules T chargées de fura-2 ont été confrontés à de stimulation SLB hébergeant pMHCs antigéniques, ICAM-1 et B-7. Cellular Fura-2 émissions excité à 340 nm et 380 nm ainsi que des images DIC ont été enregistrées. Comme indiqué, les valeurs du rapport des intensités d&#39;émission excités à 340 et 380 nm sont présentés dans le panneau de droite. Ajout de pMHC anticorps bloquant 14 min dans l&#39;essai expérimental a entraîné une diminution des niveaux de calcium intracellulaires comparable à celle des cellules T au repos. (B) Un profil temporel typique de ratios de Fura-2 moyennes dans les cellules T en contact SLBS stimulation est caractérisé par une augmentation initiale dans un calcium intracellulaire qui est 2 à 4 fois plus élevée par rapport à celle des cellules T non activées ou des cellules T antigène après privées de blocage médiée par des anticorps. Les cercles verts indiquent les points de temps illustrés dans (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figure 6. Bulk FRET rendements telle que mesurée par FRET récupération de donneur après FRET accepteur blanchiment. <strong&gt; (A) montré est un exemple d&#39;une mesure de FRET-synaptique typique. Comme cela est indiqué sur la gauche et sur ​​le dessus une série d&#39;images a été acquis à l&#39;aide d&#39;un diviseur de faisceau d&#39;émission donnant lieu à un donneur de FRET et un canal d&#39;accepteur FRET (pour plus de détails sur des diviseurs de faisceau font référence à Axmann et al 4). La ligne figurant dans l&#39;image DIC de gauche indique la limite de la synapse des cellules T. Notez la perte d&#39;intensité dans le canal de l&#39;accepteur de FRET est ainsi l&#39;augmentation de l&#39;intensité dans le canal FRET donneur après FRET accepteur blanchiment (étape 4). (B) FRET efficacité peuvent être quantifiés comme indiqué pour les régions synaptiques individuels ou synapses entières. Pour l&#39;inspection, les images avant et après FRET accepteur blanchiment sont présentés avec l&#39;utilisation de deux tables de consultation (LUT, vert et physique). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> </p&gt; <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figure 7. molécule unique FRET événements apparaissent et disparaissent étapes insingle et sont parfaitement alignés avec un seul fluorophore accepteur de FRET. Le laps de temps de la molécule unique événement FRET est représenté. Les images ont été acquises à l&#39;aide d&#39;une caméra EMCCD rétro-éclairé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figure 8. Détermination τ off = 1 / k off de trajectoires de smFRET mesurées. (A) Les sommes cumulées normalisées de signaux de FRET observables (dérivés de H57 scF V -AF555 décorées 5c.c7 TCR explosions cellules T transgénique reconnaissant IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 à 24 ° C) pendant quatre décalages de temps différentes (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms) ont été tracées en fonction du nombre total d&#39;observations. Fonctions d&#39;ajustement mono-exponentielle donnent lieu à correspondante l&#39;inverse négative des valeurs moyennes &lt;N (t lag)&gt;. (B) valeurs moyennes ont été tracées contre les retards t lag et équipés en utilisant l&#39;équation &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(T pour off / &lt;n blanchir&gt;) + t lag} pour obtenir τ off et &lt;n blanchir&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mesure de TCR-pMHC Reliure<em&gt; In Situ</em&gt; L&#39;aide d&#39;un essai basé sur la microscopie FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.2K vues.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 