Nous avons développé une méthode facile pour tester des échantillons d’aliments pour les différents toxinotypes perfringens C. Nous sommes particulièrement intéressés par la prévalence des toxines B et D qui produisent la toxine epsilon. Notre protocole permet un enrichissement et une détection faciles des différents toxinotypes perfringens C sans l’utilisation de chambres anaérobies ou d’incubateurs avec une sous-culture limitée.
Cette méthode pourrait également être utilisée pour tester le sol, l’eau, les échantillons fécaux, et plus encore. Zuha Anwar et Samantha Regan, technicienne du laboratoire, démontreront la procédure. Commencez par préparer des perfringens rapides modifiés moyens, ou RPM.
Mélanger les ingrédients selon les directives manuscrites et autoclave le mélange à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Laisser refroidir le milieu à environ 40 degrés Celsius, puis ajouter la cyclosérine D à une concentration finale de 440 milligrammes par litre. Transférer de façon aseptique le régime à 15 millilitres de tubes coniques et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à un mois.
Avant d’utiliser, chauffer le milieu à 37 degrés Celsius. Lors de la collecte d’échantillons à tester, transférez la nourriture au laboratoire selon les directives manuscrites. Si vous ne testez pas immédiatement, les aliments peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius.
Prenez note du type d’aliment et du pays d’origine, ainsi que de toute autre information pertinente. Pour tester la nourriture, transférer environ un à deux grammes dans une boîte de Pétri stérile et la hacher finement à l’aide d’une lame de rasoir stérile ou d’un scalpel. Inoculer en 10 millilitres de PBS dans un tube conique de 15 millilitres, et bien mélanger.
Sélectionnez pour les cellules végétatives en transférant cinq millilitres du mélange alimentaire PBS dans un tube conique de 15 millilitres avec 10 millilitres de régime et en fermant le couvercle hermétiquement. Sélectionnez pour les spores en chauffant les cinq millilitres restants du mélange à 85 degrés Celsius pendant 15 minutes. Et puis le transférer dans un tube avec RPM et fermer le couvercle étroitement.
Assurer un mélange complet, vortex et inverser les cultures de régime alimentaire. Ensuite, sceller hermétiquement les tubes coniques et envelopper les couvercles avec du film de paraffine pour créer un environnement anaérobie. Incubez les tubes toute la nuit à 37 degrés Celsius et notez toute turbidité ou fermentation le lendemain matin.
Préparez tryptose Sulfite Cycloserine ou TSC Agar selon la direction du fabricant, puis utilisez la technique sandwich pour l’inoculer avec des cultures rpm du jour au lendemain. Préparer la couche de base des assiettes en transférant 10 millilitres de l’agar fondu dans des boîtes de Pétrie stériles et en lui permettant de se solidifier. Maintenez le gélose TSC restant à 40 degrés Celsius pour la couche supérieure, et transférez soigneusement 100 microlitres de la culture rpm de nuit à la base d’Agar.
Certaines cultures peuvent être sous pression en raison de la fermentation, alors assurez-vous de porter tout l’équipement de protection individuelle approprié. Étendre l’inoculine avec des perles de verre stériles ou un épandeur de cellules, et laisser le RPM être absorbé dans l’agar pendant cinq à dix minutes. Ensuite, utilisez une pipette sérologique pour transférer soigneusement 20 millilitres de l’agar TSC fondu à la plaque.
Remplacer le couvercle de la boîte de Pétrie et permettre à TSC Agar de se solidifier complètement à température ambiante, puis d’inverser le plat et de l’incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Si nécessaire, effectuez des dilutions périodiques de la culture rpm avant l’inoculation dans TSC Agar. Après l’incubation, examiner les plaques pour la croissance bactérienne.
Les bactéries aérobies peuvent être présentes à la surface de l’agar, tandis que les bactéries anaérobies seront incorporées dans l’agar. Les bactéries réducteuses de sulfite transformeront l’agar environnant en noir, et les colonies possibles de perfringens de C seront noires et incorporées dans l’agar. S’il y a une quantité dense de croissance bactérienne aérobie à la surface de la plaque, utilisez un grattoir cellulaire pour enlever les colonies de zones sélectionnées.
Utilisez un goutte-à-oreille stérile à usage unique pour arracher les colonies suspectes de perfringens C de l’Agar, en vous assurant d’expulser l’air avant de percer l’agar. Transférer les colonies à 10 millilitres de régime frais dans un tube conique de 15 millilitres. Plusieurs colonies pourraient être échantillonnées à partir de la même plaque en cultures distinctes de régime.
Fixez fermement les couvercles du tube conique, enveloppez-les dans du film de paraffine et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. C perfringens est un organisme BSL deux. Il est important d’utiliser les précautions de sécurité appropriées en tout temps, en particulier lors de l’ouverture des cultures rpm du jour au lendemain et de décontaminer et d’éliminer soigneusement les supports usés.
Le lendemain, enlever les cultures nocturnes et les examiner pour la turbidité et la fermentation, puis procéder à l’extraction de l’ADN. Inversez doucement la culture du régime pour disperser les bactéries sédentées et ouvrez soigneusement le tube. Transférer un millilitre dans un tube de microcentrifugeuse et pelleter les bactéries par centrifugation.
Laver la pastille avec un millilitre de PBS stérile. Si la gélatine non digérée s’est installée au-dessus de la bactérie, l’énervée en agitant avec PBS. Aspirez doucement la gélatine et le PBS et suspendez le reste de la pastille bactérienne avec un millilitre de PBS frais.
Il est important d’enlever toute gélatine granulée avec une perturbation limitée de la pastille cellulaire. L’omission d’enlever la gélatine peut inhiber l’extraction de l’ADN et la PCR. Centrifuger les bactéries pendant 10 minutes et aspirer soigneusement le surnatant.
Effectuez ensuite l’extraction de l’ADN à l’aide d’un kit spécialement conçu pour les bactéries gram positives. Utilisez immédiatement l’ADN ou rangez-le à moins 20 degrés Celsius. Effectuer pcr sur l’ADN extrait pour déterminer si les cultures sont positives pour les toxinotypes perfringens C.
Utilisez l’ADN perfringens C comme un contrôle positif pour s’assurer que tous les reagents PCR fonctionnent. Exécutez le PCR selon les instructions manuscrites et analysez les produits avec l’électrophoresis de gel d’agarose. Ce protocole a été utilisé pour tester un total de 216 échantillons d’aliments achetés dans les magasins de détail de New York.
Les échantillons comprenaient divers échantillons de viande, des échantillons de volaille et des échantillons de fruits de mer. C perfringens Type B a été utilisé comme un contrôle positif. On a constaté que 15 à 20 % des aliments échantillonnés sont positifs pour les perfringens C.
Sur les 34 échantillons positifs, 31 échantillons contenaient la toxine alpha, un échantillon contenait la toxine alpha, bêta et epsilon. Et deux échantillons contenaient la toxine alpha et epsilon. Nous avons développé une méthode facile pour tester des échantillons d’aliments pour les différents toxinotypes perfringens C.
Nous sommes particulièrement intéressés par la prévalence des toxines B et D qui produisent la toxine epsilon.
