Merci à Michaela Hall, Larissa Bispo et Gustavo Tavares pour l&#39;assistance technique.

Les denrées alimentaires qui sont consommés crus ou légèrement cuits sont des plus préoccupantes pour la santé humaine. Les exemples incluent la salade de légumes, les fruits, les coquillages et les crustacés. Collection 1. Echantillon <ol><li> Prélever des échantillons dans des conditions qui minimisent la contamination, et stockées dans des sacs propres, séparés pendant le transport. Une fois collectés, les échantillons doivent être conservés à 4 ° C et traitées dans les 24 heures. </li></ol> 2. Culture préparation enrichie <ol><li> Fruits et légumes: <ol><li> Placer environ 10 g de matière dans un sac en plastique durable. Si le traitement des matériaux plus volumineux, se concentrer sur la peau du fruit ou du légume. Ajouter 90 ml 0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,0 et processus dans un malaxeur à pales pendant 30 sec. Alternativement, le matériau peut être agité manuellement si un mélangeur à aubes ne sont pas disponibles. </li><li> Recueillir le liquide en deux 50 ml tubes Falcon. Tubes à centrifuger à 4000 g pendant 7 min pour bactéries de pellets. </li&gt; <li> Retirer délicatement le surnageant et suspendre les bactéries en culot dans 30 ml de bouillon Luria Bertani stérile (LB). </li><li> Incuber sur un agitateur O / N, tenant un tube à 25 ° C et l&#39;autre à 37 ° C. Les cultures doivent être secoués à 200 oscillations par minute (OPM). cultures de conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol></li><li> Fruits de mer: <ol><li> Disséquer l&#39;estomac (huîtres) ou le tube digestif (de crevettes) à l&#39;aide de pinces et pinces stériles et la placer dans un tube de 1,5 ml stérile contenant 200 ul de 0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,0. Laisser macérer l&#39;échantillon pour créer un homogénat. </li><li> Distribuer 5 ml de bouillon LB en deux stériles tubes de 5 ml, et ensemencer chacun avec le broyat de fruits de mer. </li><li> Incuber sur un agitateur O / N, tenant un tube à 25 ° C et l&#39;autre 37 ° C. Les cultures doivent être secoués à 200 cpm. cultures de conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol></li></ol> 3. Cultures de dépistage pour intégrons <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Remarque: les protocoles de PCR standard sont utilisées tout au long de cette méthode, en utilisant les tampons fournis avec l&#39;enzyme, et une concentration finale de MgCl2 2,5 mM. Si nécessaire, Lorenz (2011) 24 a indiqué PCR optimisation et de dépannage méthodes dans un numéro précédent de cette revue. <ol><li> Boiled préparation de l&#39;ADN: <ol><li> Distribuer 100 ul de culture enrichi en 0,5 ml tube stérile PCR. Chauffer l&#39;échantillon à 99 ° C pendant 10 min, en utilisant un bain-marie ou un bloc chauffant. Enclenchez froid sur la glace pendant 2 min. </li><li> Microcentrifugeuse à 14 000 g pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires. Retour à la glace. Des échantillons d&#39;ADN peuvent être congelés à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire, mais doivent être décongelés sur de la glace. </li></ol></li><li> Le dépistage de la classe 1 intégrons par PCR: NOTE: cultures mixtes de la O / N incubation sont criblés pour intégrons de classe 1 utilisant le protocole HS463a / HS464 PCR (Tableau 1). <ol><li> Décongeler tous les réactifs PCR sur la glace, loin de toute sou potentielrces de l&#39;ADN contaminant. Maquillage 48 pi mastermix PCR par échantillon, y compris les contrôles négatifs (tableau 2). Distribuer 48 pi de mélange maître PCR dans chaque tube, à l&#39;aide des conseils de barrière. </li><li> Ajouter 2 ul d&#39;ADN décongelés dans des tubes de PCR individuels à l&#39;aide des conseils de barrière. Exécutez programme approprié dans le thermocycleur. </li><li> Pour évaluer les résultats de l&#39;amplification, l&#39;électrophorèse 7 pi de produit de PCR sur un gel d&#39;agarose à 2% coulé et fonctionner dans un tampon TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA). Inclure un marqueur de poids moléculaire, comme une échelle de 100 pb. </li><li> Poster tacher le gel avec une tache d&#39;ADN, et de visualiser l&#39;aide d&#39;un transilluminateur UV. Vérifiez qu&#39;il n&#39;y a pas eu d&#39;amplification dans le contrôle négatif. Une forte bande à environ 470 pb pour tout échantillon particulier indique que la culture mixte contient des bactéries qui portent un intégron de classe 1. Colonies pures vont maintenant être isolés de toute culture mixte qui a retourné une PCR positive. </li></ol></li></ol><ol><li> Des dilutions en série et des plaques de propagation: Remarque: pour isoler des colonies uniques à partir des cultures mixtes PCR-positifs, la culture mixte est dilué en série 10 fois dans un tampon de phosphate de sodium, et ensuite plaquées à récupérer des colonies uniques. <ol><li> Ajouter 1 ml de la culture mixte à 9 ml de tampon de phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0 et mélanger par retournement. Ajouter 1 ml de la dilution à une plus 9 ml de tampon phosphate, et répéter jusqu&#39;à ce qu&#39;une dilution en série de 10 -8 soit atteinte. </li><li> Étaler 100 pi des 10 -4 et 10 -8 dilutions sur une gélose LB, en double exemplaire. Incuber les plaques O / N à la même température utilisée pour la culture mixte initial. Les plaques peuvent ensuite être stockés à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire, mais il est préférable de traiter les colonies isolées assez rapidement. </li></ol></li><li> Sélection de colonie unique et préparation d&#39;ADN bouillie: <ol><li> Choisissez des colonies isolées à partir des plaques de dilution de série, soilecte autant de types de colonies différentes que possible, en utilisant des critères tels que la taille de la colonie, la forme et la couleur. Utiliser des cure-dents stériles pour sélectionner des colonies isolées de la plaque de diffusion. </li><li> Touchez le cure-dent à la colonie, puis transférer dans un tube PCR contenant 100 pi d&#39;eau stérile. Si un grand nombre de colonies doivent être examiné, puis les colonies peuvent être préparés dans une plaque de microtitrage. Faites tourner le cure-dent entre les doigts pour déloger certaines des cellules dans l&#39;eau. </li><li> En utilisant la même cure-dent, inoculer une plaque LB avec une strie de la colonie. Un grand nombre de colonies peuvent être stockés sur des plaques marquées si chaque série est d&#39;environ 1 cm de long. Répétez les étapes 1 à 3 jusqu&#39;à ce que vous avez sélectionné un nombre approprié d&#39;isolats. </li><li> Incuber les plaques LB O / N, à la même température que celle utilisée pour la culture d&#39;enrichi initial. Les cultures peuvent ensuite être conservés à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour la préparation de l&#39;ADN à partir des suspensions bactériennes, suivez les étapes que oustlined dans la section 3.1. Pour le dépistage de lysats de culture pure, effectuer le / HS464 PCR HS463a comme indiqué à la section 3.2. Isolats qui renvoient une PCR positive sera utilisé pour la préparation de l&#39;ADN génomique (section 5), et pour d&#39;autres analyses. </li></ol></li></ol> 5. Colonies simples ADN génomique Extraction de Integron-positifs Utilisation Perle Battre 25 <ol><li> Inoculer 5 ml de bouillon LB avec un échantillon de la culture pure isolée dans la section 4.2. Incuber O / N, en agitant à la même température que celle utilisée pour la culture enrichi initial. </li><li> Pellet cellules à 4000 g pendant 7 min, puis retirez le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 1 ml de solution CLS-TC dans un tube de préparation rapide Lysing Matrice E. En utilisant une machine de battage bourrelet, traiter l&#39;échantillon à 5,5 m / s pendant 30 s. </li><li> tube de centrifugeuse à 14 000 xg pendant 5 min et récupérer 700 pl de surnageant dans un tube stérile de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 700 pi de matrice de liaison dilué 1: 5 à 6 M guanidinium THIOCYANATE et mélanger à température ambiante pendant 5 min. Centrifugeuse à 14.000 g pendant 1 min, surnageant défausse. </li><li> Ajouter 800 ul de lavage à l&#39;éthanol de sel (70% d&#39;éthanol, 0,1 M d&#39;acétate de sodium) et le vortex jusqu&#39;à ce que le culot est remis en suspension entièrement. Laver pendant 5 min à température ambiante, centrifugeuse à 14.000 g pendant 1 min et éliminer le surnageant. Assurez-vous tout surnageant a été retiré, en utilisant une micropipette si nécessaire, puis laisser sécher à l&#39;air pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension le culot de matrice dans 200 ul de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) par pipetage de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Centrifuger à 14 000 g pendant 3 min et le transfert de 160 ul de l&#39;ADN élue dans un tube stérile. Exécuter une aliquote de l&#39;extraction de l&#39;ADN génomique sur un gel d&#39;agarose à 2% p / v de vérifier le rendement et l&#39;intégrité de l&#39;extraction de l&#39;ADN. L&#39;ADN génomique purifié est stocké à -20 ° C et décongelés sur de la glace lorsque cela est nécessaire pour les tests de PCR. </li></ol> 6. PCR de diagnostic et séquençage de l&#39;ADN NOTE: Lel&#39;ADN génomique préparé à l&#39;article 5 sera utilisé pour toutes les PCR de diagnostic, et pour confirmer le test positif pour intégrons de classe 1. <ol><li> Décongeler l&#39;ADN génomique sur la glace, Vortex brièvement l&#39;échantillon d&#39;ADN et l&#39;impulsion de spin à 14.000 g pendant 20 sec. Répétez le PCR pour le gène de classe 1 de intégron-intégrase utilisant HS463a / HS464 (tableau 1), ce qui confirme que l&#39;isolat est positif pour l&#39;amplicon de 471 pb (section 3.2). </li><li> Identification des cultures positives à niveau de l&#39;espèce est obtenue par l&#39;analyse de la petite sous-unité de gène ARNr (ADNr 16S). Amplifier le gène 16S utilisant les amorces F27 / r1492 (tableau 1). Vérifiez les produits de PCR par électrophorèse. Toutes les cibles bactériennes devraient générer un amplicon 16S d&#39;environ 1450 pb. </li><li> Séquence du gène amplicon ARNr 16S pour déterminer l&#39;identité de l&#39;espèce, mais comme il ya probablement plusieurs PCR positifs de l&#39;étape 6.2, et beaucoup de ces points positifs seront les mêmes espèces bactériennes, nous allons d&#39;abord distinguer les différentes espèces using digestion de restriction du produit PCR 16S. <ol><li> Digérer un aliquote de la PCR 16S avec l&#39;enzyme de restriction Hinf 1. Toute enzyme qui reconnaît les sites de clivage de 4 pb feront, mais Hinf 1 génère une bonne diversité d&#39;objectifs de 16S, et est, une enzyme fiable et économique. </li></ol></li><li> Mettre en place une restriction de 30 ul digérer mastermix (tableau 2) dans un tube stérile et ajouter 20 ul de produit PCR 16S non purfied. Incuber dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau O / N. Vérifiez la digestion sur un gel agarose à 2%. </li><li> Note les profils de digestion produites par Hinf 1. Les isolats avec le même profil de restriction 16S sont susceptibles d&#39;être la même espèce. Plutôt que de séquençage de chaque produit PCR 16S, séquence au plus trois représentants de chaque motif de restriction Hinf 1. </li><li> Purifier les produits PCR 16S en utilisant un kit commercial. Un kit d&#39;exonucléase simple brin peut être utilisé, mais basée colonne ou des procédés de précipitation fonctionne aussi bien pour enlever Unincamorces orporated et des ADN simple brin. Séquence amplicons 16S en utilisant l&#39;amorce r910 (tableau 1), mise en place des réactions comme spécifié par l&#39;installation de séquençage. </li><li> Utilisation de la séquence d&#39;ADN résultant d&#39;interroger la base de données NCBI d&#39;ADN avec la fonction de BLASTN ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). D&#39;identité en nucléotides supérieur à 97% est généralement considéré comme l&#39;identité de l&#39;espèce. </li></ol> 7. Cartographie et caractérisation des intégrons et cassettes Arrays NOTE: Classe 1 intégrons émanant écosystèmes dominés par les humains sont susceptibles d&#39;être intégrons les plus communs dans tous les échantillons. Ces intégrons tous avoir une origine unique récente, et donc avoir une séquence d&#39;ADN hautement conservée 5. <ol><li> La différence entre un intégrons de classe 1 émanant de sources humaines et ceux qui se produisent naturellement dans des échantillons environnementaux en effectuant unePCR avec l&#39;amorce fixée intI1F165 / intI1R476 10 (tableau 1). NOTE: intégrons de classe 1 de bactéries commensales ou cliniques vont générer un produit ~ 300 pb, tandis que la classe environnementale 1 intégrons ne génèreront pas de produit. </li><li> Caractériser les intégrons cliniques en amplifiant le tableau de cassette avec ensemble d&#39;amorces HS458 / HS459. Cette PCR amplifier la région entre intI1 segment conservé et l&#39;extrémité 3 &#39;à l&#39;extrémité de la plupart des ensembles de cassettes. Parce que le nombre et l&#39;identité des cassettes est variable, la taille du produit de PCR varie également. </li><li> Purifier amplicons et séquencer l&#39;ADN en utilisant chacune des amorces d&#39;amplification. Utiliser des séquences d&#39;interroger les bases de données d&#39;ADN en utilisant la fonction de blastn ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Veiller à nommer des cassettes suivre la nomenclature normalisée 9, puisque de nombreux dépôts de données pour cassette du gène intégrons utiliser des noms incohérentes ou ambiguës. Accorder une attention particulière à de nouvelles cassettes de gènes, puisque ceux-ci peuvent encoder de nouveaux phénotypes, y compris les gènes qui confèrent une transmissibilité interhumaine accrue, la pathogénicité ou la virulence 8,21. NOTE: préclinique formes de la classe 1 intégron circulent encore dans les milieux naturels. En particulier, ceux qui sont liés aux actifs Tn 402 transposons sont plus d&#39;intérêt 26. Les tableaux de ces intégrons de cassettes ne seront pas amplifier en présence des amorces HS458 / HS459, mais peuvent être amplifié avec l&#39;MRG284 / MRG285 ensemble d&#39;amorces (tableau 1), générant amplicons de taille variable dépendante sur le contenu de la cassette. Les produits de PCR doivent être purifiés et l&#39;ADN séquencé tel que décrit dans 7.2. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples.">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li><li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module.">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li><li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+in+the+environment:+A+link+to+the+clinic.">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li><li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community.">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li><li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).</li><li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil.">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li></ol>

Les auteurs ont rien de pertinent de divulguer.

L&#39;identification des intégrons et leurs cassettes de gènes associés est potentiellement une étape clé dans la prédiction de l&#39;émergence de nouveaux pathogènes opportunistes, suivi des voies pour les agents pathogènes dans la chaîne alimentaire humaine, et l&#39;identification de nouvelles résistances et de la virulence déterminants 8,21,26. Le but de cet article était de décrire une approche rationalisée pour le dépistage des échantillons pour intégrons de classe 1, caractérisant le...

La découverte des antibiotiques a été l&#39;une des plus grandes réalisations scientifiques du 20 ème siècle. Cependant, l&#39;utilisation et l&#39;abus des antibiotiques a conduit à l&#39;évolution rapide des bactéries résistantes aux antibiotiques, et ceux-ci pose maintenant une menace sérieuse pour la santé publique dans le 21 e siècle. La hausse de souches bactériennes résistantes à la plupart des options de traitement soulève la possibilité que nous entrons dans une ère où les médicaments antimicrobiens ne sont plus efficaces 1,2. Le mécanisme génétique qui confère une résistance aux antibiotiques est un ancien système, précédant les humains et les pressions de sélection antibiotiques par des millions d&#39;années 3. Éléments génétiques mobiles, tels que les plasmides, les transposons, îlots génomiques, les éléments et les intégrons conjugatifs intégratives peuvent diffuser des gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) à l&#39;intérieur et entre les espèces bactériennes 4. Parmi ceux-ci, intégrons ont joué un rôle central dans la propagation de l&#39;ARG, malgré lafait qu&#39;ils reposent sur ​​des plasmides et des transposons pour la mobilisation et l&#39;insertion dans les génomes bactériens 5. Les intégrons capturer cassettes de gènes en utilisant une intégron-intégrase, puis expriment cassettes en utilisant un promoteur intégron codé 6,7 (Figure 1). Integron gène cassettes sont de petits éléments mobiles constitués de simples cadres de lecture ouverts (ORF) dont les produits peuvent conférer une résistance aux antibiotiques ou de désinfectants 8. Intégrons de classe 1 sont les intégrons le plus souvent récupérées à partir d&#39;isolats cliniques 5, où ils ont acquis collectivement plus de 130 différentes cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques 9. La propagation de la classe 1 intégrons dans commensales et bactéries pathogènes humains associés génère des flux de déchets humains qui contiennent un grand nombre de ces éléments génétiques 10. On estime à 10 19 bactéries qui contiennent intégrons de classe 1 sont libérés par les boues chaque année in le Royaume-Uni 11. Il est donc pas surprenant que les intégrons de classe 1 conférant des résistances aux antibiotiques sont maintenant détectés dans le microbiote des oiseaux sauvages, de poissons et d&#39;autres animaux sauvages indigènes de 12-14. Libérer intégrons dans l&#39;environnement constitue une menace importante pour la santé publique, depuis l&#39;acquisition de nouvelles cassettes de gènes et des réarrangements complexes avec d&#39;autres éléments mobiles continue à se produire, en particulier dans les stations d&#39;épuration et d&#39;autres plans d&#39;eau 15-18. L&#39;environnement naturel devient alors un terrain fertile pour le recrutement de nouveaux déterminants de la résistance et des pathogènes opportunistes 19,20. Bactéries contenant de intégron-nouveaux et de nouvelles ARG peuvent encercler retour dans la communauté humaine à travers l&#39;eau et les aliments contaminés 21,22. Surveillance de l&#39;environnement ARG est une stratégie clé pour la compréhension et la gestion de la résistance aux antibiotiques dans l&#39;avenir 23. En particulier, l&#39;attention devrait être accordée aux denrées alimentaires qui sont consommés crus oulégèrement cuits, puisque ceux-ci présentent la plus grande menace pour la transmission de nouveaux éléments mobiles et des agents pathogènes. Dans ce protocole, une approche simplifiée pour détecter, identifier et caractériser les intégrons de classe 1 et leurs cassettes de gènes associés dans les denrées alimentaires sont décrits (Figure 2). En utilisant une combinaison de la réaction et de la culture en chaîne par polymérase (PCR), intégrons peuvent être détectés rapidement dans les communautés bactériennes complexes et les isolats individuels. Des procédés pour l&#39;identification des espèces de bactéries et de la conformation et de l&#39;identité des cassettes de gènes associés à intégron sont donnés. La méthode est adaptée pour une large gamme d&#39;aliments végétaux et animaux, et des exemples de workflows typiques sont donnés pour chacun de ces types d&#39;aliments.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GoTaq Colourless Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7132</td>
			<td>Used in all PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6513-10MG</td>
			<td>Used in all PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinFI restriction enzyme</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6201</td>
			<td>Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp ladder</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27400701</td>
			<td>Used as a size standard on all agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed DNA stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium Thiocyanate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9422</td>
			<td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLS-TC Solution</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6540409</td>
			<td>Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix E FastPrep tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116914500</td>
			<td>Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binding matrix</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116540408</td>
			<td>Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Prep machine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>Number of options available</td>
			<td>MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening foodstuffs for class 1 integrons and gene cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

Projection de cultures mixtes et isolats bactériens pour intI1 Amorce HS463a / HS464 PCR peut être utilisée pour détecter la présence du gène de classe 1 de intégron-intégrase, intI1 (Figure 1). Ce jeu d&#39;amorces fonctionne bien pour détecter intI1 dans les cultures mixtes, et est également utilisé pour cribler des colonies bactériennes récoltées à partir de plaques de propagation (Figure 2). Isolats positifs devraient géné...

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Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Dépistage denrées alimentaires pour les intégrons de classe 1 et Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

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Research

JoVE Journal

Environment

9.0K vues.  Macquarie University. This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs. 

Vidéo: Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Recherche

Environnement

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Criblage à semi-haute de la sécheresse de tolérance potentiel dans la laitue (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) de matériel génétique dans les collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

Dosage Comportements Alimentation prédatrices dans<em&gt; Pristionchus</em&gt; Et d&#39;autres nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Le dépistage de la Endocrine Activité en eau à l&#39;aide disponibles dans le commerce<em&gt; In vitro</em&gt; Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protocole pour microplastiques échantillonnage sur la surface de la mer et analyse des échantillons

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extraction de pesticides organochlorés à partir de granulés en plastique et analyse de type plastique

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in the Earth&#39;s atmosphere, a central process in meteorology, hydrology, and for the climate system. But because specific extraction and characterization of these compounds have been lacking for decades, very little is known on their identity, properties, mode of action and origins, thus preventing the full understanding of cloud formation and its potential links with the Earth&#39;s ecosystems.
In this paper we present recently developed methods for 1) the targeted extraction of all the surfactants from atmospheric aerosol samples and for the determination of 2) their absolute concentrations in the aerosol phase and 3) their static surface tension curves in water, including their Critical Micelle Concentration (CMC). These methods have been validated with 9 references surfactants, including anionic, cationic and non-ionic ones. Examples of results are presented for surfactants found in fine aerosol particles (diameter &#60;1 &#956;m) collected at a coastal site in Croatia and suggestions for future improvements and other characterizations than those presented are discussed.

Methods are presented for the targeted extraction of surfactants present in atmospheric aerosols and the determination of their absolute concentrations and surface tension curves in water, including their Critical Micelle Concentration (CMC).

Extraction et caractérisation des tensio-actifs de l&#39;atmosphère Aérosols

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation des pommes de terre et de l’activité du promoteur d’un gène de subérine par GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Dépistage denrées alimentaires pour les intégrons de classe 1 et Gene Cassettes

Résumé

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Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

Criblage à semi-haute de la sécheresse de tolérance potentiel dans la laitue (

Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

Dosage Comportements Alimentation prédatrices dans

Le dépistage de la Endocrine Activité en eau à l'aide disponibles dans le commerce

Protocole pour microplastiques échantillonnage sur la surface de la mer et analyse des échantillons

Extraction de pesticides organochlorés à partir de granulés en plastique et analyse de type plastique

Extraction et caractérisation des tensio-actifs de l'atmosphère Aérosols

balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation des pommes de terre et de l’activité du promoteur d’un gène de subérine par GUS Staining