Ce protocole décrit une technique de ciblage des médicaments d’intérêt pour les macrophages larvaire du poisson zèbre pour manipuler et évaluer la fonction macrophage. Cette technique présente des avantages par rapport aux stratégies traditionnelles d’administration de médicaments, comme l’immersion, en veillant à ce que les médicaments soient spécifiquement ciblés sur les macrophages par encapsulation liposome. Lorsqu’elle est appliquée aux modèles de la maladie du poisson zèbre avec une composante inflammatoire, cette technique a le potentiel de résoudre la façon dont les macrophages contribuent aux processus pathologiques.
Ici, nous démontrons l’utilité de cette technique en ciblant un médicament mitochondrial-réactif d’espèce d’oxygène inhibant aux macrophages pour supprimer l’activation. La microinjection de liposomes chargés de drogue en larves peut être difficile, car il faut prendre soin de ne pas causer de dommages épithéliales excessifs, ce qui pourrait influencer les études immunologiques. La démonstration visuelle de ce protocole est importante parce qu’elle implique des méthodologies pharmacologiques et entières de cellules vivantes animales qui peuvent ne pas être exécutées systématiquement dans un seul laboratoire.
Pour préparer 10 milligrammes de liposomes dans un flacon rond-fond de 25 millilitres, ajouter 31 nanomolaires de bleu marine et 300 nanomolaires d’un médicament inhibiteur des espèces d’oxygène mitochondriale réactive au flacon. Sonicate brièvement pour dissoudre complètement, et enlever le solvant lentement sur un évaporateur rotatif placé sur un bain d’eau de 45 degrés Celsius à 75 rotations par minute sous pression sous vide. Lorsqu’un film mince lipidique sec s’est formé dans les parois vitrées du flacon, séchez davantage le film pendant 45 minutes sous azote pour faciliter l’élimination complète du solvant organique.
Ensuite, hydratez le film avec un millilitre de PBS, et scellez le flacon avec du film de paraffine avant d’agiter le flacon à la main sur un bain d’eau de 60 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après sept cycles de congélation et de décongélation, utilisez un mini-extrudeuse et des membranes en polycarbonate gravées sur voie d’un micromètre pour extruder les liposomes pendant deux à six cycles. Lorsque de grandes vésicules unilamellar ont été obtenues, condensez les liposomes frais en granulés par ultracentrifugation.
Incuber la pastille avec une millilitre de 1% poloxamer 188 solution pendant 30 minutes à 45 degrés Celsius et 750 rotations par minute dans un ThermoMixer avec une fixation de tube de microcentrifugeuse de deux millilitres. Pendant l’insertion de poteau du poloxamer 188 dans les liposomes, la concentration correcte de poloxamer, le temps d’incubation, et la température sont importants pour réaliser les caractéristiques physicochimiques optimales des liposomes résultants. À la fin de l’incubation, ultracentrifugez à nouveau le mélange dans les mêmes conditions de centrifugeuse, et retirez le supernatant contenant n’importe quel polymère ou médicament non lié.
Rangez ensuite les granulés liposome à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Pour déterminer la taille et le potentiel zeta des liposomes, diluer la formulation liposome avec de l’eau ultrapure à un rapport d’un à 100. Utilisez un analyseur dynamique de diffusion de la lumière pour mesurer la taille des particules, l’indice de polydispersité et le potentiel de zeta en triplicate à 25 degrés Celsius.
Pour calculer l’efficacité du piégeage et la charge médicamenteuses des liposomes, dissoudre les liposomes dans Triton X-100. Injectez 20 microlitres de l’échantillon liposome dissous dans un système de chromatographie liquide haute pression avec une pompe quaternaire, un détecteur de réseau de diodes réglé à 230 nanomètres et une colonne de trois micromètres, 250 fois 4,6 millimètres. Pour préparer les larves transgéniques de poisson zèbre à l’injection, utilisez des forceps à pointe fine pour déchorionner manuellement 30 heures d’embryons post-fécondation et permettre aux embryons de se développer à 28,5 degrés Celsius jusqu’à deux jours après la fécondation.
Lorsque les embryons ont atteint le stade approprié, diluer une formulation liposome fraîchement préparée à un rapport un pour un dans le PBS stérile, et mélanger la solution pendant deux à trois secondes par vortex. Verser suffisamment de cellulose méthylique à 3 % dans le milieu de l’E3 dans le couvercle d’un petit couvercle de plat de culture de 35 millimètres pour former un film mince couvrant toute la surface. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour recueillir un bassin d’environ 20 à 25 larves anesthésiées.
Laissez les embryons se concentrer à l’extrémité de la pipette par gravité, et transférez soigneusement les larves au milieu du couvercle de plat de culture de 35 millimètres avec une solution minimale. Utilisez une chargeuse microcapillaire pour fixer les larves avec leurs antérieurs vers le haut de la plaque d’injection avec la surface dorsale orientée vers l’aiguille de microinjection pour injection dans le ventricule de l’arrière-pensée ou avec leurs antérieurs vers la gauche de la plaque d’injection avec les surfaces ventrales orientées vers l’aiguille de microinjection pour injection dans le venosus sinusal. Utilisez une chargeuse microcapillaire pour remplir une aiguille d’injection d’environ cinq microlitres du mélange d’injection liposome.
Montez l’aiguille dans un micromanipulateur relié à un support magnétique et un injecteur de pression, et placez la configuration sous un microscope stéréo. Utilisez des forceps propres à pointe fine pour couper la pointe de l’aiguille de microinjection pour générer une ouverture d’environ cinq micromètres de diamètre. Réglez l’injecteur à une durée d’impulsion d’environ 50 millisecondes et une pression d’injection d’environ 40 livres par pouce carré.
Injecter un bolus dans une goutte d’huile minérale placée au-dessus des lignes de grille d’un hémocytomètre pour calibrer le volume à injecter. Ajustez ensuite la durée de l’impulsion et/ou la pression d’injection jusqu’à ce que le diamètre du bolus couvre 2 1/2 des plus petites lignes de grille. Injectez soigneusement un nanolitre du mélange d’injection liposome dans le ventricule postbrain de chaque larves.
Immédiatement après les injections, ajouter le milieu E3 à la plaque d’injection et utiliser une pipette de transfert en plastique pour agiter doucement les larves hors de la cellulose méthylique. Pour visualiser la surface dorsale de l’arrière-pays sur un microscope confocal équipé d’une lentille d’immersion d’eau, remplissez d’abord un plat de culture de 35 millimètres à une profondeur de cinq millimètres avec un support de montage, et laissez le milieu polymériser. Creuser une petite tranchée dans l’agarose d’une zone suffisante pour accueillir le sac jaune de l’embryon expérimental, et utiliser une pipette de transfert en plastique rempli de milieu de montage fondu pour recueillir une larve anesthésiée.
Déposez immédiatement la larve dans le plat de culture et utilisez une chargeuse microcapillaire pour orienter le côté ventral du sac jaune vers le bas dans les trous excavés. Maintenir l’embryon dans cette position jusqu’à ce que l’agarose polymérise. Superposer l’embryon avec e3 moyen complété avec 200 microgrammes par millilitre de tricaine.
Pour vivre l’image du ventricule arrière, sélectionnez l’objectif 20x, et réglez le microscope confocal à 512 par 512 pixels et un zoom de 2,5 x. Lorsque les paramètres du microscope ont été définis, acquérir des piles Z de 40 micromètres sur trois s’étendant de la surface la plus dorsale de l’arrière-cerveau à l’aide de l’imagerie à deux canaux pour imager les liposomes fluorescents bleus et les macrophages fluorescents verts. Lorsque toutes les images ont été obtenues, chargez les fichiers dans un logiciel d’analyse d’image 3D approprié.
Sous l’onglet Mesure, faites glisser le protocole Trouver des objets dans les tâches de traînée ici pour faire des mesures d’espace. Sélectionnez le canal DAPI pour mettre en évidence les liposomes et faites glisser l’outil Inspect à travers les sections Z pour détecter les macrophages chargés de liposophage. Pour quantifier l’intensité de fluorescence des liposomes dans les cellules individuelles, faites glisser le clip vers les régions d’intérêt dans les tâches de traînée ici pour faire des mesures d’espace, et utilisez l’outil Rectangle pour dessiner une boîte autour de la cellule d’intérêt dans les dimensions X, Y et Z.
Sélectionnez ensuite Effectuer l’élément de mesure dans le menu décrochage des mesures pour générer un fichier de mesure dans la fenêtre de la bibliothèque. Dans ce tableau, la taille, le potentiel de zeta, la charge de drogue, et l’efficacité de piégeage des liposomes produits sont résumés. Comme on l’a observé, la taille des particules des liposomes est similaire avec et sans chargement de drogue, bien que la charge de surface des liposomes chargés de drogue soit légèrement plus neutre que les liposomes témoins avec le bleu marin seulement.
La microinjection de liposomes marins étiquetés bleus dans le ventricule de l’arrière-facteur, comme démontré, entraîne une absorption rapide par les macrophages résidents qui peuvent être facilement quantifiés par microscopie confoccale par trois heures après l’injection. Les neutrophiles, cependant, sont rarement observés pour contenir des liposomes intracellulaires. Dans les macrophages individuels chargés de liposomes, les liposomes s’accumulent dans les compartiments phagolysosomal, ce qui est nécessaire pour la dégradation liposome et la libération subséquente de contenu de drogue dans le cytoplasme.
La livraison dans le venosus de sinus peut livrer les liposomes aux macrophages hematopoietic caudal de tissu-résident par l’intermédiaire de la circulation. La microinjection des liposomes chargés du médicament inhibiteur des espèces d’oxygène mitochondrial-réactif dans le ventricule hindbrain peut supprimer de manière significative la production d’espèces d’oxygène mitochondrial-réactive monosodique urate dans les macrophages postérieurs-résidents liposome-chargés. D’autres validations des effets suppressifs des drogues d’intérêt sur des états d’activation de macrophage peuvent être exécutées en étudiant l’expression proinflammatory de gène de cytokine par hybridation in situ entière de montage et le recrutement temporel des neutrophiles.
En utilisant cette technique, nous avons été en mesure de cibler les médicaments à macrophages pour confirmer qu’un mécanisme immunométabolique conduit leur activation dans un modèle larvaire poisson zèbre de l’inflammation aiguë gouty. Les adaptations futures de ce protocole pourraient inclure l’exécution de la modification de surface du liposome pour augmenter le ciblage de macrophage ou pour favoriser le ciblage à d’autres cellules immunisées, telles que des neutrophiles.
