Les auteurs tiennent à remercier Cui Chao, étage de Kort, Stoop Esther et Ralph Carvalho pour les images de la figure 4, Ulrike Nehrdich et Davy de Witt pour les soins de poissons, et les membres de laboratoire pour d&#39;autres discussions utiles. Ce travail est soutenu par le Programme Smart Mix du ministère néerlandais des affaires économiques et le ministère de l&#39;Education, la Culture et de la Science, de la 7ème Commission européenne cadre du projet ZF-Santé (Santé-F4-2010-242048), l&#39;Union européenne Marie-Curie Formation initiale réseau FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), et par le NHMRC australien (637 394). L&#39;Australien de médecine régénérative Institut est soutenu par des subventions du gouvernement de l&#39;État de Victoria et le gouvernement australien.

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish.">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. 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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les méthodes d&#39;infection décrites dans cet article sont fréquemment utilisés pour étudier la fonction de gènes de l&#39;hôte de l&#39;immunité innée ou des gènes de virulence bactériens 1. Les micro-injection par voie intraveineuse (méthodes des protocoles 5 et 6.1) sont utilisés le plus souvent pour de telles études. La veine caudale à l&#39;île du sang postérieure est l&#39;endroit le plus commode pour l&#39;injection intraveineuse de 1-jour vieux embryons. Comme la veine caudale devient plus difficile de pénétrer à des stades ultérieurs, nous préférons le canal de Cuvier en tant que site d&#39;injection par voie intraveineuse pour les embryons à 2-3 dpf. Dans tous les cas, il est essentiel d&#39;injecter des embryons avec des chiffres cohérents de bactéries, ce qui doit être vérifiée par l&#39;injection de placage inoculums pour le comptage des CFU. Les aspects suivants doivent être considérés pour atteindre injections reproductibles. Tout d&#39;abord, il est essentiel de disposer d&#39;aiguilles de haute qualité en verre injection microcapillaires. Si la pointe de l&#39;aiguille est trop grande, l&#39;injection va créer un trou de perforation assez grand pour des saignements de se produire etles bactéries injectées s&#39;écoule de la circulation sanguine. Deuxièmement, les bactéries doivent être injectés directement dans la circulation sanguine. Si la pointe de l&#39;aiguille n&#39;est pas à l&#39;intérieur de la veine ou si les écarts de fluides d&#39;injection dans l&#39;extension du sac vitellin, l&#39;embryon doit être mis au rebut de l&#39;expérience. Troisièmement, à l&#39;aide PVP40 comme support pour injecter M. marinum aidera à prévenir les bactéries de sombrer dans l&#39;aiguille de verre. PVP40 améliore l&#39;homogénéité de la suspension, ce qui entraîne inoculums plus reproductibles pendant toute la durée d&#39;injections. PVP40 peut également être utilisé pour S. injections typhimurium, mais ici il est moins important parce que la plus grande taille et de la fluorescence lumineuse des bactéries permet un contrôle visuel sur l&#39;inoculum d&#39;injection au cours des expériences. Pour pratiquer les injections, nous recommandons l&#39;utilisation de phénol colorant rouge (1% v / v) ou 1 pm sphères fluorescentes disponibles en différentes couleurs (Invitrogen). Une fois que la technique est maîtrisée, il faut environ 30 minutes pour injecter 50-100 embryons, y compris le temps nécessaire pour aligner les embryons sur des plaques d&#39;agarose et le réglage du volume d&#39;injection bactérienne. Alors que les injections intraveineuses dans l&#39;île du sang (protocole 5) ou dans le canal de Cuvier (protocole 6.1) sont les plus couramment utilisés, les autres voies d&#39;infection décrites dans cet article la vidéo se sont révélées utiles pour étudier des macrophages et des neutrophiles chimiotactisme (protocoles 6.2, 6.3 , et 6.4), pour étudier la croissance des souches bactériennes atténuées (protocole 6.5), et d&#39;adapter le modèle d&#39;infection le poisson-zèbre pour applications à haut débit (protocole 6.6) 4-8. Les décrits de micro-injection méthodes peuvent également être appliquées pour des injections de virus 18, 19, les spores fongiques 14, 20 ou parasites protozoaires (Maria Forlenza, communication personnelle). Un complément utile aux procédures d&#39;injection décrites dans cet article la vidéo est une procédure récemment décrit pour injection sous-cutanée de bactéries dans zebrembryons afish 21. Cette procédure a été appliquée à l&#39;étude la phagocytose des bactéries par les neutrophiles, qui ont été trouvés pour les bactéries de manière efficace sur les surfaces des tissus engloutissent, mais, contrairement à macrophages, étaient pratiquement incapables de phagocyter les bactéries lors de l&#39;injection dans le sang ou dans les cavités corporelles remplies de liquide. Pour les embryons injections sous-cutanées sont positionnés les mêmes que pour les injections musculaires queue décrites dans cet article la vidéo, mais l&#39;aiguille est insérée sous la peau pour injecter des bactéries sur une somite. Il est important de considérer que la micro-injection est essentiellement une voie artificielle de l&#39;infection. Cependant, les embryons précoces sont très résistants à l&#39;exposition externe aux pathogènes bactériens. En fait, les essais d&#39;immersion, où les embryons sont baignés dans une suspension bactérienne, ne sont pas reproductibles dans nos mains 22. Alors que certains embryons peuvent être infectés lors de l&#39;immersion, nous avons observé une grande variation dans les taux de mortalité et de l&#39;expressions de gènes marqueurs inflammatoires entre les embryons individuels dans de tels essais. Les méthodes d&#39;injection de micro-décrites dans cet article d&#39;atteindre les infections reproductibles et sont particulièrement utiles pour étudier les interactions bactéries avec les cellules immunitaires innées d&#39;accueil. Une approche efficace pour quantifier une infection bactérienne chez les embryons individuels est d&#39;analyser les images fluorescentes d&#39;embryons infectés par le sur-mesure, le logiciel dédié pixel quantification 17, 23. Cette approche a été démontré une bonne corrélation avec les résultats de UFC après placage d&#39;embryons infectés. De même, les changements relatifs dans le nombre de leucocytes par embryon ont été quantifiés par analyse d&#39;image numérique dans les lignes de leucocytes transgéniques journaliste fluorophores; cette approche serait applicable à la quantification de la réponse de l&#39;hôte à l&#39;infection leukopoietic 24. La fonction de gènes immunitaires innées de l&#39;hôte peuvent être étudiés efficacement in vivo par la combinaison des modèles d&#39;infection décritesavec effet de choc morpholino. Morpholinos sont des oligonucléotides antisens synthétiques qui ciblent ARN spécifiques et de réduire l&#39;expression des produits géniques lorsqu&#39;il est injecté dans 1-cellules embryons de poisson zèbre scène comme le montre la vidéo d&#39;autres articles dans cette revue 10, 25. Dans les études knockdown morpholino, il est d&#39;une grande importance que tous les groupes d&#39;embryons doivent être comparées sont mis en scène correctement avant les injections bactériennes. Ceci est particulièrement important parce que les embryons ont un système immunitaire en développement qui devient de plus en plus compétente au fil du temps. Il ya plusieurs lignes de reporter transgéniques actuellement disponibles pour distinguer les grands sous-ensembles innées immunitaire, les macrophages et les polynucléaires neutrophiles, en embryons de poisson zèbre. Le megapixels et promoteurs Lyz ont été utilisés pour générer des lignes de reporter neutrophiles 16, 26, 27, et le CSF1R (FMS) et MPEG1 promoteurs ont été utilisés pour produire des journalistes macrophages 14, 28. Alors que csf1r (FMS) est en outre exprimé dans xanthophores, mpeg1 expression est exclusivement dans les macrophages. Comme le montre dans cet article la vidéo, les mpeg1 récemment mis au point des lignes journaliste sont très utiles pour la phagocytose par les macrophages imagerie bactérienne.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Fournisseur </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco agar Middlebrook 7H10 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC enrichissement </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Bouillon Middlebrook 7H9 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC enrichissement </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-phénylthiourée (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Ethyl 3-aminobenzoate sel de méthanesulfonate (tricaïne) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Méthylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarose (agarose à faible point de fusion) </td><td> Lonza Inc </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 um, rouge fluorescent (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 um, jaune-vert fluorescent (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

Poisson zèbre (Danio rerio) embryons sont de plus en plus utilisé comme un modèle pour étudier la fonction du système immunitaire des vertébrés innée dans les interactions hôte-pathogène 1. Les principaux types de cellules du système immunitaire inné, les macrophages et les neutrophiles, les développer au cours des premiers jours de l&#39;embryogenèse avant la maturation des lymphocytes qui sont nécessaires pour les réponses immunitaires adaptatives. La facilité d&#39;obtention de grands nombres d&#39;embryons, leur accessibilité en raison du développement externe, la transparence optique de stades embryonnaire et larvaire, un large éventail d&#39;outils génétiques, de vastes ressources mutantes et des collections de lignes de reporter transgéniques, tous les ajouter à la polyvalence du poisson-zèbre modèle. Salmonella enterica sérotype Typhimurium (S. typhimurium) et Mycobacterium marinum peut résider intracellulaire dans les macrophages et sont fréquemment utilisés pour étudier les interactions hôte-pathogène chez les embryons de poisson zèbre. Les processus d&#39;infection de ces deuxdes bactéries pathogènes sont intéressants à comparer car S. infection aiguë et typhimurium est mortelle dans la journée, tandis que M. l&#39;infection marinum est chronique et peut être imagée en place au stade larvaire 2, 3. Le site de micro-injection de bactéries dans l&#39;embryon (Figure 1) détermine si l&#39;infection deviendra rapidement systémique ou un premier temps restent localisées. Une infection systémique rapide peut être établie par micro-injection des bactéries directement dans la circulation sanguine via la veine caudale à l&#39;île du sang postérieure ou via le canal de Cuvier, un canal large diffusion sur le sac vitellin reliant le cœur de la vascularisation du tronc. Au 1 dpf, lorsque les embryons à ce stade ont macrophages phagocytically actifs, mais les neutrophiles n&#39;ont pas encore mûri, l&#39;injection dans l&#39;île du sang est préférable. Pour les injections à 2-3 dpf, lorsque les embryons ont également développé fonctionnels (myéloperoxydase-productrice) neutrophiles, le canal de Cuvier est préférable que tsite d&#39;injection, il. Pour étudier la migration dirigée des cellules myéloïdes vers les infections locales, les bactéries peuvent être injectés dans le muscle queue, vésicule otique, ou rhombencéphale ventricule 4-6. En outre, la notochorde, une structure qui semble être normalement inaccessibles aux cellules myéloïdes, est très sensible à l&#39;infection locale 7. Une alternative utile pour applications à haut débit est l&#39;injection de bactéries dans le jaune d&#39;embryons dans les premières heures après la fécondation 8. La combinaison de bactéries fluorescentes et les lignes de poisson-zèbre transgénique avec des macrophages ou de neutrophiles fluorescentes crée des conditions idéales pour l&#39;imagerie multi-couleur des interactions hôte-pathogène. Cet article décrira vidéo des protocoles détaillés pour l&#39;infection par voie intraveineuse et locale des embryons de poisson zèbre avec S. typhimurium ou M. bactéries marinum et pour l&#39;imagerie de fluorescence ultérieure de l&#39;interaction avec les cellules du système immunitaire inné.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l&#39;étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels que<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Micro-injection de bactéries et de multi-couleur d&#39;imagerie de fluorescence sont des techniques essentielles intervenant dans l&#39;application de poisson-zèbre modèles d&#39;infection d&#39;embryons.

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.4K vues.  Leiden University. Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l'étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels que Salmonella typhimurium Et Mycobacterium marinum. Micro-injection de bactéries et de multi-couleur d'imagerie de fluorescence sont des techniques essentielles intervenant dans l'application de poisson-zèbr...