Notre nouveau protocole nous permet en fait de visualiser les structures cellulaires en 3D en utilisant la tomographie calculée aux rayons X. Et nous le faisons en souinant les tissus avec de l’éosine et de cette façon rendre le cytoplasme visible. Outre les applications médicales et la recherche, nous pensons également que notre méthode peut être appliquée en biologie comme, par exemple, la recherche en zoologie ou la biologie du développement.
La technique est relativement simple, très rapide, et également adapté pour les échantillons de tissus plus grands. Nous pensons que notre approche combinée à la tomographie micro-calculée aux rayons X peut être intégrée dans le flux de travail clinique et aider les pathologistes à prendre de meilleures décisions. Commencez par fixer les échantillons de tissus mous.
Remplissez un tube de centrifugeuse de 50 millilitres avec une solution fixative contenant 9,5 millilitres de formaldéhyde à 4 % et 0,5 millilitres d’acide acétique glaciaire. Ajouter l’échantillon de tissus mous au tube de centrifugeuse et réfrigérer de 24 à 72 heures. Après réfrigération laver l’échantillon de tissus mous avec la solution DPBS pendant une heure.
Ensuite, tacher l’échantillon en le plaçant dans deux millilitres de solution de coloration Eosin Y et l’incuber sur une plaque de secousse horizontale pendant 24 heures. Le lendemain, retirez soigneusement l’échantillon de tissus mous du contenant de l’échantillon et retirez l’agent de coloration excédentaire avec du papier de soie cellulose. Placez-le dans un récipient conique au-dessus d’une phase de vapeur d’éthanol pour le stockage et une utilisation ultérieure.
Préparez un porte-échantillon approprié pour monter l’échantillon de tissus mous selon les directives manuscrites et assurez-vous d’un ajustement serré pour empêcher l’échantillon de se déplacer pendant les mesures de tomodensive aux rayons X. Une fois que l’adhésif s’est durci et que le porte-échantillon est prêt à l’emploi, transférez le rein de la souris dans le tube de centrifugeuse intact qui contient quelques gouttes de 70 % d’éthanol au fond. Placez l’échantillon monté dans le scanner à rayons X.
Après avoir soigneusement aligné l’échantillon, choisissez les paramètres d’acquisition pour la meilleure qualité d’image. Pour les données micro CT présentées, acquérir l’analyse à une tension maximale de 50 kilovolts et un courant de 3,5 watts en utilisant 1601 projections réparties également sur 360 degrés. Utilisez ensuite les données micro CT de l’analyse de vue d’ensemble pour sélectionner la région d’intérêt pour la tomodensitométrie haute résolution.
Préparer les volumes d’intérêt de l’échantillon de tissus mous en le coupant en très petits morceaux d’environ 0,5 millimètre de longueur de bord à l’aide d’un scalpel et d’un microscope stéréo. Si vous utilisez un rein de souris, coupez-le en deux moitiés le long de l’axe le plus long. Prenez la moitié et préparez différentes régions anatomiques telles qu’un cortex rénal et une médulle rénale.
Transférer les petits morceaux dans une nouvelle boîte de Petri pour déshydrater. Déshydratez les échantillons à l’aide d’une série de solutions d’éthanol selon les directives manuscrites, effectuant chaque étape de déshydratation pendant une heure. Transférer les échantillons déshydratés dans la capsule microporeuse et la fermer.
Gardez les échantillons en contact avec 100% éthanol en tout temps. Puis point critique sécher les petits morceaux de tissu. Une fois que les échantillons de tissus sont préparés, conservez-les dans une nouvelle boîte de Pétri stockée dans un dessiccateur avant d’être utilisés.
Montez les morceaux de tissu sur un support d’échantillon approprié assurant un ajustement serré. Pour un rein de souris superglue les morceaux à un porte-échantillon à l’aide d’un microscope stéréo. Après un alignement minutieux de l’échantillon, choisissez les paramètres d’acquisition pour la meilleure qualité d’imagerie.
Pour les données nano-CT présentées, acquérir des projections à une tension maximale de 60 kilovolts avec 1599 projections réparties également sur 360 degrés et une taille voxel d’environ 400 nanomètres. Ce protocole a été employé pour la visualisation 3D des structures microscopiques de tissu d’un rein de souris. Les mesures micro CT à basse résolution ont permis une vue d’ensemble de l’ensemble de l’organe et ont permis d’identifier les volumes d’intérêt pour les mesures à haute résolution.
Le même rein de souris a été utilisé pour obtenir des données micro CT haute résolution. Une vue plus détaillée des structures anatomiques telles que le cortex, la médulle externe, et la médulle intérieure entre autres est réalisée. Un volume de rendu d’intérêt montre la région de medulla et une section virtuelle à travers le navire.
Le nano-CT a été utilisé pour obtenir une vue détaillée de l’échantillon de rein au niveau cellulaire. Un petit morceau de tissu obtenu à partir du rein entier de souris a été employé pour imager les membres ascendants épais de la boucle de Henle avec une taille de voxel d’environ 400 nanomètres. Une étude comparative a été effectuée pour s’assurer que le nano-CT est entièrement compatible avec l’histopathologie.
L’approche d’imagerie multimodale a confirmé les résultats obtenus avec les deux méthodes. Pendant l’étape d’incubation, il est crucial que l’échantillon soit entièrement entouré par la solution de coloration. En outre, lors de l’exécution de l’imagerie par rayons X CT, le fait le plus important est d’assurer la stabilité de l’échantillon lors de l’acquisition de données.
Les échantillons de tissus mous qui ont été analysés avec notre protocole peuvent être analysés plus en utilisant la technique histologique standard telle que la contre-coloration de l’hématoxyline. Notre protocole de coloration contribuera considérablement à faire progresser l’histologie des rayons X 3D. La recherche médicale bénéficiera particulièrement de cette technique d’imagerie 3D non détruite.
