Nous présentons la pathologie d’expansion, ou ExPath pour faire court, une mesure à faible coût pour l’image biomolécule d’intérêt dans les sections cliniques standard de tissu, avec la précision nanométrique. ExPath contourne la limite de diffraction de la microscopie lumineuse conventionnelle en infusant chimiquement la section des tissus cliniques avec un hydrogel habitable à l’eau, puis en élargissant physiquement et uniformément les échantillons traités d’une centaine de fois, permettant ainsi aux biomolécules étiquetées fluorescentes précédemment superposées d’être séparées et observées avec un microscope optique conventionnel. ExPath permet aux utilisateurs d’étudier les configurations à l’échelle nanométrique des biomolécules liées à la maladie dans les échantillons de tissus, sans avoir besoin d’investir dans de nouveaux matériels d’imagerie.
Ainsi, permettant de nouvelles perspectives de la maladie et favorisant un nouveau diagnostic. Cette méthode peut être appliquée à un large éventail de types de tissus et être utilisée pour fournir un nouvel aperçu de la pathogénie de diverses maladies complexes, telles que le cancer, les maladies du cerveau, les maladies auto-immunes, et d’autres. La démonstration visuelle est importante pour illustrer comment faire les étapes critiques correctement, telles que la construction de la chambre de gelage et la manipulation de l’échantillon gélgélisé avant et après la digestion de Proteinase K.
Commencez par convertir le tissu d’intérêt en un format compatible ExPath. Si vous travaillez avec des échantillons cliniques FFPE, placez la diapositive avec l’échantillon dans un tube conique de 50 ml et ajoutez 15 ml de Zylène. Caper le tube et le placer horizontalement sur un shaker orbital vers 60rpm pendant trois minutes.
Répéter le lavage avec 15 ml de Zylène. Ensuite, lavez la diapositive dans une série de dilutions d’éthanol, selon les instructions manuscrites. Si vous travaillez avec des glissières permanentes tachées et montées, placez chaque diapositive dans un tube conique de 50 ml, puis couvrez-la de Zylène.
Retirer délicatement le bordereau de couverture à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, traiter la diapositive de la même manière que les échantillons cliniques FFPE. Si vous travaillez avec des diapositives de tissu congelé non fixé dans la solution OCT, fixez le tissu en acétone à 20 degrés Celsius pendant dix minutes, puis lavez les échantillons avec la solution 1X PBS trois fois pendant dix minutes par lavage.
Si vous traitez des échantillons cliniques préalablement fixes et congelés, laissez les glissières pendant deux minutes à température ambiante pour faire fondre la solution de gré à gré, puis lavez l’échantillon avec 1X PBS trois fois, pendant cinq minutes par lavage. Après conversion de format, effectuer la récupération des antigènes sur tous les échantillons. Chauffer la solution de citrate de 20 millimolaires à 100 degrés Celsius au micro-ondes et placer la glissière dans la solution.
Transférez immédiatement le récipient dans une chambre d’incubation et incubez-le à 60 degrés Celsius pendant trente minutes. Pour tacher l’échantillon, utilisez un stylo hydrophobe pour tracer une limite autour de la section tissulaire sur la lame. Placez la lame dans une boîte de Pétri, puis incubez le tissu avec le tampon de blocage pendant une heure à 30 degrés Celsius.
Ensuite, incuber les tissus avec la solution d’anticorps primaire pendant au moins trois heures à température ambiante ou 37 degrés Celsius. Après l’incubation, lavez le tissu trois fois avec le tampon bloquant, et incubez-le dans la solution secondaire d’anticorps pendant au moins une heure à la température ambiante, ou 37 degrés Celsius. Répétez les lavages avec le tampon de blocage, puis effectuez l’imagerie fluorescente, à l’aide d’un microscope classique à champ large ou d’un autre système d’imagerie de choix.
Préparer la solution d’ancrage selon les instructions manuscrites. Placez les glissières dans une boîte de Pétri de 100 ml, pipet la solution d’ancrage sur le tissu, et les incuber pendant au moins trois heures à température ambiante. Ensuite, préparez la solution de geling selon les directives manuscrites.
Retirez l’excès de solution d’ancrage de la section tissulaire et placez la glissière dans la boîte de Pétri. Ajouter une solution de gelage froid frais à l’échantillon et incuber le mélange pendant trente minutes, à quatre degrés Celsius. Pour construire une chambre sur la glissière autour de l’échantillon, créez des espaceurs en coupant finement des morceaux de verre de couverture avec un couteau à diamants.
Fixez les entretaires de chaque côté du tissu avec de l’eau et placez soigneusement un couvercle de couverture sur la glissière, en vous assurant d’éviter de piéger les bulles d’air sur le tissu. Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié pendant deux heures. Retirez le couvercle de la chambre de gel en glissant doucement une lame de rasoir sous le coverslip et soulevez-le lentement de la surface du gel.
Couper le gel blanc autour du tissu pour minimiser le volume, en s’assurant de couper le gel de façon asymétrique pour suivre l’orientation. Diluer proteinase K un à deux cents dans le tampon de digestion, en s’assurant de préparer suffisamment de solution pour submerger complètement le gel. Ensuite, incuber l’échantillon avec la solution dans un récipient fermé pendant trois heures à 60 degrés Celsius.
Si l’échantillon ne se détache pas pendant la digestion, utilisez une lame de rasoir pour l’enlever délicatement. Utilisez un pinceau souple pour transférer l’échantillon en 1X PBS dans un récipient compatible avec le système d’imagerie désiré et suffisamment grand pour accueillir le gel entièrement élargi. Lavez l’échantillon en PBS pendant dix minutes et si désiré restain avec 300 millimolar DAPI.
Élargir les échantillons en lavant l’échantillon avec un volume excédentaire d’eau distillée double trois à cinq fois pendant dix minutes par lavage. Ensuite, effectuez l’imagerie par fluorescence. Si ce protocole est exécuté avec succès, les échantillons apparaissent comme un gel plat et transparent après homogénéisation mécanique et peuvent se développer par un facteur de 3 à 4,5 dans l’eau.
Un échantillon de rein FFPE de cinq micromètres d’épaisseur a été élargi 4,5 fois, ce qui a donné lieu à une résolution de 63 nanomètres à l’aide d’un objectif de 0,95 NA. Le tissu a ensuite été converti en un format compatible de pathologie d’expansion et taché d’anticorps pour Alpha Actinin 4 et Vimentin, DAPI pour visualiser l’ADN nucléaire, et Wheat Germa Glutenin pour étiqueter les glucides. La microscopie confocale de disque filature a alors été employée pour l’image du spécimen.
Le tissu rénal a ensuite été complètement élargi dans l’eau et reproduit. La fissuration, les distorsions et la perte de cibles étiquetées peuvent être le résultat d’un ancrage ou d’une homogénéisation inadéquats. Le tissu normal taché d’hématoxyline et d’éosine de sein a été traité comme échantillon de FFPE, étendu, étiqueté avec DAPI, et imité sur un microscope confocal de disque filature.
Des tranches de rein non coupées et congelées ont également été traitées à l’aide de ce protocole. Le tissu a été fixé dans l’acétone froide et taché avec Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI, et glutenin germa de blé. Lors de l’exécution de cette technique, il est important de se rappeler le moment de l’étape de gelation est critique.
La gelation prématurée peut causer des distorsions, limiter l’expansion et entraîner la perte de molécules cibles. Après cette procédure, l’imagerie fluorescente peut être effectuée au microscope après la digestion et l’expansion de l’échantillon. ExPath peut être largement appliqué dans les deux pathologies et au-delà.
Car il permet aux chercheurs de visualiser des détails subtils dans les échantillons de tissus d’intérêt. Par conséquent, il peut aider les chercheurs à acquérir de nouvelles idées sur la pathogénie des maladies ou des mécanismes des processus biologiques.
