L’imagerie cellulaire vivante permet l’observation de processus cellulaires dynamiques au fil du temps au sein d’une seule cellule. Ces approches sont puissantes pour évaluer les conditions qui ont un impact sur le processus dynamique de division cellulaire et révéler les impacts que les défauts de la mitose ont sur la prolifération et la viabilité des cellules souches. La phototoxicité qui résulte de l’exposition à la lumière pendant l’imagerie représente un défi important associé à ce protocole.
Par conséquent, les temps d’exposition et l’intervalle et la durée d’imagerie doivent être optimisés. En utilisant une technique aseptique et une armoire de sécurité de niveau biosécurité deux, utilisez une pipette pasteur stérile en verre jetable pour aspirer le milieu de la plaque de culture contenant la ligne cellulaire portant la construction d’expression d’intérêt. Lavez brièvement les cellules avec 10 millilitres de PBS stérile avec tourbillonnant et traitez les cellules avec deux millilitres de trypsine de 0,05%.
Après deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius, ajouter huit millilitres de milieu frais à la plaque pour arrêter la réaction et réutiliser les cellules détachées avec un tuyautage doux. Transférer la solution cellulaire dans un tube stérile de 15 millilitres et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de PBS et centrifugez à nouveau les cellules.
Resuspendez la pastille en 10 millilitres de milieu pour compter et diluer les cellules à une à deux fois 10 à la 5ème cellule par millilitre de concentration moyenne de culture cellulaire. Puis ensemencer 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque inférieure stérile d’imagerie de 12 puits et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pour permettre aux cellules d’adhérer à la surface de la plaque. Pas plus de 30 minutes avant l’imagerie, ajoutez une concentration pertinente d’un médicament mitotique à un ou plusieurs puits et ajoutez un volume égal de diluant inhibiteur au même nombre de puits que les témoins.
Pour préparer le microscope à l’imagerie, placez la plaque sur le stade d’un microscope à épifluorescence inversé équipé d’une caméra haute résolution, d’une chambre environnementale préchauffée à 37 degrés Celsius et d’un système de livraison de dioxyde de carbone humidifié à 5 %. Sélectionnez un objectif d’air 20 fois avec une ouverture numérique de 0,5 et équipé pour la fluorescence à contraste élevé et le contraste de phase, ou l’imagerie de champ lumineux et de voir les cellules pour ajuster le cours et trouver la mise au point pour mettre les cellules au point. Pour définir les temps d’exposition optimaux pour l’acquisition d’images de champ lumineux, de GFP et de DP, sélectionnez les cubes de filtre respectifs avec l’excitation et l’émission appropriées pour les fluorophores qui seront photographiés et cliquez sur Lecture.
Si le signal n’est pas suffisamment intense, ajustez l’exposition automatique et, dans chaque canal fluorophore, sélectionnez le binning approprié dans le menu déroulant format. Sélectionnez et calibrez l’étape du microscope jusqu’au plat multi-puits selon les instructions du fabricant et utilisez le logiciel d’acquisition d’images pour mettre en évidence ou sélectionner autrement les puits qui seront photographiés. Ouvrez le panneau de contrôle des points générés et, dans le cadre de la zone de travail, sélectionnez Restreint et Frontière pour restreindre la zone de sélection coordonnée afin d’exclure les limites du puits.
Dans le menu de dropdown de restriction de zone, sélectionnez Zone entière et sélectionnez un placement aléatoire de points. Réglez le nombre à six et cliquez sur Randomize pour sélectionner le nombre et la distribution des points à capturer par puits, respectivement. Cliquez ensuite et entrez les valeurs dans le panneau de contrôle de séquence de temps pour sélectionner et saisir l’intervalle de temps et la durée de collecte des images.
Pour visualiser la chromatine étiquetée RFP-H2B, sélectionnez les images capturées avec le cube de filtre RFP en place et identifiez une cellule entrant dans la mitose comme l’indiquent le compactage initial de la chromatine et la dégradation de l’enveloppe nucléaire afin de déterminer le moment mitotique de l’alignement de la métaphyse et l’apparition de l’anaphase dans les cellules individuelles. Suivez la cellule d’intérêt à travers des points de temps consécutifs dans le film acquis pour déterminer le nombre de points de temps ou de minutes de l’entrée mitotique jusqu’à ce que la chromatine étiquetée RFP-H2B complète l’alignement à l’équateur cellulaire pendant la métaphyse. Pour surveiller le moment mitotique, la fidélité mitotique et le destin cellulaire, continuez à suivre la cellule à travers des points de temps consécutifs pour identifier la coordonnée de temps à laquelle la ségrégation chromosomique d’anaphase est apparente et/ou quand la décomposition de chromatine et la réforme d’enveloppe nucléaire se sont produites.
Visualisez ensuite la DP-H2B pour identifier les cellules de chaque population qui présentent des défauts mitotiques, y compris des chromosomes à la traîne et des ponts de chromatine pendant la ségrégation chromosomique de l’anaphase. En visualisant alpha tubulin-EGFP, on peut observer que les cellules qui éprouvent la perturbation de fuseau subissent des changements dynamiques pendant que la focalisation de traction de fuseau est réalisée et qu’un fuseau mitotic bipolaire est formé en préparation pour la division cellulaire. Parallèlement à l’assemblage du fuseau, le mouvement chromosomique peut être visualisé avec la DP-H2B pour évaluer l’alignement chromosomique et la fidélité à la ségrégation.
À l’aide d’approches d’imagerie cellulaire en direct, ces résultats représentatifs montrent que les cellules dont le contenu centrosome normal est capable de passer de la dégradation de l’enveloppe nucléaire à l’alignement de la métaphyse et à l’apparition de l’anaphase pour atteindre une division bipolaire en moins de 30 minutes. En présence de centrosomes supplémentaires, près de 50% des cellules sont capables de surmonter un fuseau mitotique multipolaire transitoire et de former un fuseau bipolaire dans la division cellulaire complète. Les cellules restantes sont incapables d’atteindre un fuseau bipolaire et, par conséquent, la mitose de sortie par une division multipolaire.
Indépendamment de si la bipolarité de fuseau est atteinte, les cellules avec des centrosomes supplémentaires montrent une durée sensiblement accrue de mitose comparée aux cellules avec deux centrosomes. Indiquant que la dynamique de la progression mitotique peut être modifiée même lorsque les changements dans les résultats mitotiques ne sont pas apparents. Lorsque vous définissez les temps d’exposition pour les canaux fluorescents, optimisez les temps d’exposition pour limiter la phototoxicité.
Aussi binning pixel caméra peut être sélectionné pour permettre des temps d’exposition plus faibles à utiliser. Cette procédure a des applications dans les criblages pharmacologiques, l’invasion, et l’analyse de migration. Ces approches peuvent également être utilisées pour examiner l’efficacité des traitements médicamenteux ou la dynamique de la motilité cellulaire.
