L'imaging cellulare vivo consente l'osservazione di processi cellulari dinamici nel tempo all'interno di una singola cellula. Questi approcci sono potenti per valutare le condizioni che hanno un impatto sul processo dinamico di divisione cellulare e rivelare gli impatti che i difetti della mitosi hanno sulla proliferazione e sulla vitalità delle cellule figlie. La fototossicità che deriva dall'esposizione alla luce durante l'imaging rappresenta una sfida significativa associata a questo protocollo.
Pertanto, i tempi di esposizione e l'intervallo e la durata dell'imaging dovrebbero essere ottimizzati. Utilizzando la tecnica aseptica e un armadio di sicurezza di livello due di biosicurezza, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro monouso sterile per aspirare il mezzo dalla piastra di coltura contenente la linea cellulare che porta il costrutto di espressione di interesse. Lavare brevemente le cellule con 10 millilitri di PBS sterile con vorticoso e trattare le cellule con due millilitri dello 0,05% di tripside.
Dopo due o cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere otto millilitri di mezzo fresco alla piastra per fermare la reazione e rimostrare le cellule staccate con una delicata pipettazione. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo sterile da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Rimorsi il pellet in 10 millilitri di PBS e centrifugare di nuovo le cellule.
Resostigliere il pellet in 10 millilitri di mezzo per contare e diluire le cellule a una o due volte 10 alla 5a cella per millilitro di concentrazione media di coltura cellulare. Quindi seminare 500 microlitri di cellule in ogni pozzo di una piastra inferiore sterile da 12 porsi e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per consentire alle cellule di aderire alla superficie della piastra. Non più di 30 minuti prima dell'imaging, aggiungere una concentrazione rilevante di un farmaco mitotico a uno o più pozzi e aggiungere un volume uguale del diluente inibitore allo stesso numero di pozzi dei controlli.
Per preparare il microscopio per l'imaging, posizionare la piastra sullo stadio di un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di una telecamera ad alta risoluzione, una camera ambientale preriscaldata a 37 gradi Celsius e un sistema di erogazione per l'anidride carbonica umidificata al 5%. Selezionare un obiettivo aria 20 volte superiore con un'apertura numerica di 0,5 e attrezzato per la fluorescenza ad alto contrasto e il contrasto di fase, o l'imaging a campo luminoso e visualizzare le celle per regolare il corso e trovare messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule. Per impostare i tempi ottimali di esposizione per l'acquisizione di immagini di campo luminoso, GFP e RFP, selezionare i rispettivi cubi di filtro con l'eccitazione e l'emissione appropriate per i fluorofori che verranno immaginati e fare clic su Riproduci.
Se il segnale non è sufficientemente intenso, regolare l'esposizione automatica e in ogni canale del fluorofore selezionare il binning appropriato dal menu a discesa Formato. Selezionare e calibrare lo stadio del microscopio sul piatto multi-pozzo secondo le istruzioni del produttore e utilizzare il software di acquisizione delle immagini per evidenziare o selezionare in altro modo i pozzi che verranno imageati. Aprite il pannello di controllo punti generati e in Area di lavoro selezionate Limitato (Restricted) e Bordo (Border) per limitare l'area di selezione delle coordinate per escludere i limiti del pozzo.
Nel menu a discesa Restrizione area (Area Restriction), selezionate Intera area (Whole Area) e selezionate un posizionamento casuale dei punti. Impostare il conteggio su sei e fare clic su Randomize per selezionare rispettivamente il numero e la distribuzione dei punti da catturare per pozzo. Quindi fare clic e immettere i valori nel pannello di controllo della sequenza temporale per selezionare e inserire l'intervallo di tempo e la durata per la raccolta delle immagini.
Per visualizzare la cromatina etichettata RFP-H2B, selezionare le immagini acquisite con il cubo filtrante RFP in posizione e identificare una cellula che entra nella mitosi come indicato dalla compattazione iniziale della cromatina e dalla rottura dell'involucro nucleare per determinare la tempistica mitotica dell'allineamento della metafase e dell'esordio di anafase nelle singole cellule. Traccia la cella di interesse attraverso punti di tempo consecutivi nel filmato acquisito per determinare il numero di punti di tempo o minuti dall'ingresso mitotico fino a quando la cromatina etichettata RFP-H2B completa l'allineamento all'equatore cellulare durante la metafase. Per monitorare la tempistica mitotica, la fedeltà mitotica e il destino cellulare, continuare a tracciare la cellula attraverso punti temporali consecutivi per identificare la coordinata temporale in cui la segregazione cromosomica anafase è evidente e /o quando si è verificata la decomposizione della cromatina e la riforma dell'involucro nucleare.
Quindi visualizzare RFP-H2B per identificare le cellule in ogni popolazione che presentano difetti mitotici, inclusi cromosomi in ritardo e ponti di cromatina durante la segregazione cromosomica dell'anafase. Visualizzando alfa tubulina-EGFP, si può osservare che le cellule che sperimentano l'interruzione del mandrino subiscono cambiamenti dinamici man mano che si ottiene la messa a fuoco del mandrino e si forma un mandrino mitotico bipolare in preparazione alla divisione cellulare. In concomitanza con l'assemblaggio del mandrino, il movimento cromosomico può essere visualizzato con RFP-H2B per valutare l'allineamento cromosomico e la fedeltà alla segregazione.
Utilizzando approcci di imaging a cellule vive, questi risultati rappresentativi mostrano che le cellule con un normale contenuto di centrosoma sono in grado di procedere dalla rottura dell'involucro nucleare attraverso l'allineamento della metafase e l'insorgenza dell'anafase per ottenere una divisione bipolare in meno di 30 minuti. In presenza di centrisomi extra, quasi il 50% delle cellule è in grado di superare un mandrino mitotico multipolare transitorio e di formare un mandrino bipolare in completa divisione cellulare. Le cellule rimanenti non sono in grado di ottenere un mandrino bipolare e, di conseguenza, escono dalla mitosi attraverso una divisione multipolare.
Indipendentemente dal fatto che si ottiene il bipolarismo del mandrino, le cellule con centrosomi extra mostrano una durata significativamente maggiore della mitosi rispetto alle cellule con due centrosomi. Indicando che la dinamica della progressione mitotica può essere alterata anche quando i cambiamenti nel risultato mitotico non sono evidenti. Quando si definiscono i tempi di esposizione per i canali fluorescenti, ottimizzare i tempi di esposizione per limitare la fototossicità.
È inoltre possibile selezionare il binning dei pixel della fotocamera per consentire l'uso di tempi di esposizione inferiori. Questa procedura ha applicazioni in screening farmacologici, invasione e analisi della migrazione. Questi approcci possono anche essere utilizzati per esaminare l'efficacia dei trattamenti farmacologici o la dinamica della motilità cellulare.
