Визуализация живых клеток позволяет осуществлять наблюдение динамических клеточных процессов с течением времени в пределах одной ячейки. Эти подходы являются мощными для оценки условий, которые влияют на динамический процесс деления клеток и выявления воздействия дефектов митоза на пролиферацию и жизнеспособность клеток дочери. Фототоксичность, которая является результатом воздействия света во время визуализации представляет собой серьезную проблему, связанную с этим протоколом.
Таким образом, время экспозиции и интервал изображения и продолжительность должны быть оптимизированы. Используя асептическую технику и биобезопасность уровня 2 шкаф безопасности, использовать стерильные одноразовые стеклянные пипетки Пастер аспирировать среды от культуры пластины, содержащей клеточной линии проведения выражение построить интерес. Кратко мыть клетки с 10 миллилитров стерильных PBS с закрученного и лечения клеток с двумя миллилитров 0,05%трипсина.
Через две-пять минут при 37 градусах по Цельсию добавьте восемь миллилитров свежей среды к пластине, чтобы остановить реакцию и повторно поместить отдельные клетки с нежной пипетки. Перенесите клеточный раствор в стерильную 15-миллилитровую трубку и соберите клетки путем центрифугации. Повторное распределение гранул в 10 миллилитров PBS и центрифуги клеток снова.
Resuspend гранулы в 10 миллилитров среды для подсчета и разбавить клетки в один-два раза от 10 до 5 клеток на миллилитр клеточной культуры средней концентрации. Затем семя 500 микролитров клеток в каждый колодец стерильной 12-хорошо изображения нижней пластины и поместить пластину в инкубатор культуры клеток, чтобы клетки придерживаться поверхности пластины. Не более чем за 30 минут до визуализации добавьте соответствующую концентрацию митотического препарата в одну или несколько скважин и добавьте равный объем разгибаемого ингибитора к тому же количеству скважин, что и элементы управления.
Чтобы подготовить микроскоп для визуализации, поместите пластину на сцену перевернутого микроскопа эпифлюоресценции, оснащенного камерой высокого разрешения, экологической камерой, разогретой до 37 градусов по Цельсию, и системой доставки для увлажнения 5%-ного углекислого газа. Выберите 20-х раз воздушную цель с численной диафрагмой 0,5 и оснащены для высокой контрастности флуоресценции и фазового контраста, или яркие изображения поля и просматривать клетки, чтобы настроить курс и найти фокус, чтобы привести клетки в фокусе. Чтобы установить оптимальное время экспозиции для яркого поля, GFP и rfP изображения приобретения, выберите соответствующие кубики фильтра с соответствующим возбуждением и выбросов для флюорофоров, которые будут изображены и нажмите Play.
Если сигнал недостаточно интенсивный, отрегулируйте автоматическое воздействие и в каждом канале флюорофора выберите соответствующее биннинг из меню высадки формата. Выберите и откалибровать стадию микроскопа для нескольких колодцев в соответствии с инструкциями производителя и используйте программное обеспечение для получения изображений, чтобы выделить или иным образом выбрать скважины, которые будут изображены. Откройте сгенерированную панель управления точками и в пределах рабочей зоны выберите Ограниченную и Пограничную, чтобы ограничить область выбора координат, чтобы исключить границы колодец.
В меню высадки ограничения зоны выберите Всю область и выберите случайное размещение тока. Установите количество до шести и нажмите Randomize, чтобы выбрать количество и распределение точек, которые будут захвачены за колодец, соответственно. Затем нажмите на кнопку и введите значения в панели управления последовательностью времени, чтобы выбрать и ввести интервал времени и продолжительность сбора изображений.
Чтобы визуализировать RFP-H2B помечены хроматин, выберите изображения, снятые с rfP фильтр куб на месте и определить клетки ввода митоза, как указано на первоначальном уплотнение хроматина и распада ядерной оболочки, чтобы определить митотические сроки выравнивания метафазы и анафазы начала в отдельных клетках. Отслеживайте ячейку интереса через последовательные точки времени в приобретенном фильме, чтобы определить количество точек времени или минут от митотической записи до тех пор, пока RFP-H2B помеченный хроматин не завершит выравнивание на клеточном экваторе во время метафазы. Для мониторинга митотических сроков, митотической верности и судьбы клеток, продолжайте отслеживать клетку через последовательные временные точки, чтобы определить координаты времени, в которых очевидна сегрегация хромосомы анафазы и/или когда произошла декоматиновая декомпакция и реформирование ядерной оболочки.
Затем визуализировать RFP-H2B для выявления клеток в каждой популяции, которые проявляют митотические дефекты, в том числе отстающие хромосомы и хроматин мосты во время анафазной хромосомной сегрегации. Путем визуализировать альфа-тубулин-EGFP, можно наблюдать что клетки которые испытывают нарушение шпинделя проходят динамические изменения по мере того как шпиндель вытягивать фокусировка достигается и биполярный митотический шпиндель сформирован в подготовке к разделению клетки. Параллельно с сборкой шпинделя, хромосомное движение может быть визуализировано с RFP-H2B для оценки выравнивания хромосом и сегрегации верности.
Используя подходы к визуализации живых клеток, эти репрезентативные результаты показывают, что клетки с нормальным содержанием центросомы способны исходить из распада ядерной оболочки через выравнивание метафазы и анафазное начало для достижения биполярного деления менее чем за 30 минут. В присутствии дополнительных центросом, почти 50% клеток способны преодолеть переходный многополярный митотический шпиндель и сформировать биполярный шпиндель в полном деление клеток. Остальные клетки не в состоянии достичь биполярного шпинделя и, как следствие, выйти митоз через многополярное деление.
Независимо от того, спиндель биполярность достигается, клетки с дополнительными центросомами проявляют значительно увеличенную продолжительность митоза по сравнению с клетками с двумя центросомами. Указание на то, что динамика митотической прогрессии может быть изменена даже в тех случаев, когда изменения в митотических результатах не очевидны. При определении времени экспозиции для флуоресцентных каналов оптимизируйте время экспозиции, чтобы ограничить фототоксичность.
Также может быть выбрано биннинг пикселей камеры, чтобы позволить использовать более низкое время экспозиции. Эта процедура имеет применение в фармакологических скринингах, вторжении и анализе миграции. Эти подходы также могут быть использованы для изучения эффективности медикаментозного лечения или динамики клеточной подвижности.
