La imagen de células vivas permite la observación de procesos celulares dinámicos a lo largo del tiempo dentro de una sola célula. Estos enfoques son potentes para evaluar las condiciones que afectan el proceso dinámico de división celular y revelar los impactos que los defectos en la mitosis tienen en la proliferación y viabilidad de las células hijas. La fototoxicidad que resulta de la exposición a la luz durante la toma de imágenes representa un desafío significativo asociado con este protocolo.
Por lo tanto, se deben optimizar los tiempos de exposición y el intervalo y la duración de la imagen. Utilizando una técnica aséptica y un gabinete de seguridad de nivel dos de bioseguridad, utilice una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril para aspirar el medio de la placa de cultivo que contiene la línea celular que lleva la construcción de expresión de interés. Lavar brevemente las células con 10 mililitros de PBS estéril con remolinos y tratar las células con dos mililitros de 0.05%trypsin.
Después de dos a cinco minutos a 37 grados Celsius, agregue ocho mililitros de medio fresco a la placa para detener la reacción y resuspender las células separadas con pipeteo suave. Transfiera la solución celular a un tubo estéril de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Resuspender el pellet en 10 mililitros de PBS y centrifugar las células de nuevo.
Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio para contar y diluir las células a una de una a dos veces 10 a las 5a células por mililitro de concentración media de cultivo celular. Luego sembra 500 microlitros de células en cada pozo de una placa inferior de imágenes estériles de 12 pozos y coloca la placa en la incubadora de cultivo celular para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa. No más de 30 minutos antes de la toma de imágenes, añadir una concentración relevante de un medicamento mitótico a uno o más de los pozos y añadir un volumen igual del diluyente inhibidor al mismo número de pozos que los controles.
Para preparar el microscopio para la toma de imágenes, coloque la placa en el escenario de un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con una cámara de alta resolución, una cámara ambiental precalentada a 37 grados centígrados y un sistema de entrega de dióxido de carbono humidificado al 5%. Seleccione un objetivo de aire 20 veces con una apertura numérica de 0,5 y equipado para la fluorescencia de alto contraste y el contraste de fase, o imágenes de campo brillante y vea las celdas para ajustar el curso y encontrar el enfoque para enfocar las células. Para establecer los tiempos de exposición óptimos para la adquisición de imágenes de campo brillante, GFP y RFP, seleccione los cubos de filtro respectivos con la excitación y emisión adecuadas para los fluoróforos que se crearán imágenes y haga clic en Reproducir.
Si la señal no es lo suficientemente intensa, ajuste la exposición automática y, en cada canal de fluoróforo, seleccione el binning adecuado en el menú desplegable Formato. Seleccione y calibrar la etapa del microscopio a la antena multi-pozo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilice el software de adquisición de imágenes para resaltar o seleccionar los pozos que se van a tomar una imagen. Abra el panel de control de puntos generados y, en Zona de trabajo, seleccione Restringido y Borde para restringir el área de selección de coordenadas para excluir los límites del pozo.
En el menú desplegable Restricción de área, seleccione Área completa y seleccione una ubicación aleatoria de puntos. Establezca el recuento en seis y haga clic en Aleatorizar para seleccionar el número y la distribución de los puntos que se van a capturar por pozo, respectivamente. A continuación, haga clic e introduzca los valores en el panel de control de secuencia de tiempo para seleccionar e introducir el intervalo de tiempo y la duración de la recopilación de las imágenes.
Para visualizar la cromatina etiquetada RFP-H2B, seleccione las imágenes capturadas con el cubo de filtro RFP en su lugar e identifique una célula que entra en la mitosis como se indica en la compactación inicial de cromatina y la descomposición de la envolvente nuclear para determinar el tiempo mitótico de la alineación de la metafase y el inicio de la anafase en las células individuales. Realice un seguimiento de la célula de interés a través de puntos de tiempo consecutivos en la película adquirida para determinar el número de puntos de tiempo o minutos desde la entrada mitótica hasta que la cromatina etiquetada RFP-H2B complete la alineación en el ecuador de celda durante la metafase. Para monitorear el momento mitótico, la fidelidad mitótica y el destino celular, continúe rastreando la célula a través de puntos de tiempo consecutivos para identificar la coordenada de tiempo en la que la segregación cromosómica anáfasis es aparente y/o cuando se ha producido la descomposición de la cromatina y la reforma de la envolvente nuclear.
Luego visualice RFP-H2B para identificar las células en cada población que presentan defectos mitóticos, incluyendo cromosomas rezagados y puentes de cromatina durante la segregación cromosómica anafásica. Al visualizar la tubulina-EGFP alfa, se puede observar que las células que experimentan interrupción del husillo experimentan cambios dinámicos a medida que se logra el enfoque de tracción del husillo y se forma un husillo mitótico bipolar en preparación para la división celular. Simultáneamente con el ensamblaje del husillo, el movimiento del cromosoma se puede visualizar con RFP-H2B para evaluar la alineación del cromosoma y la fidelidad de segregación.
Utilizando enfoques de imágenes de células vivas, estos resultados representativos muestran que las células con un contenido centroomario normal son capaces de proceder de la descomposición de la envolvente nuclear a través de la alineación de la metafase y el inicio de la anafase para lograr una división bipolar en menos de 30 minutos. En presencia de centroomas adicionales, casi el 50% de las células son capaces de superar un husillo mitótico multipolar transitorio y formar un husillo bipolar en la división celular completa. Las células restantes son incapaces de lograr un husillo bipolar y, como resultado, salen de la mitosis a través de una división multipolar.
Independientemente de si se logra la bipolaridad del husillo, las células con centroomas adicionales exhiben una duración significativamente mayor de la mitosis en comparación con las células con dos centroomas. Indicando que la dinámica de la progresión mitótica puede alterarse incluso cuando los cambios en el resultado mitótico no son evidentes. Al definir los tiempos de exposición para los canales fluorescentes, optimice los tiempos de exposición para limitar la fototoxicidad.
También se puede seleccionar el binning de píxeles de la cámara para permitir que se utilicen tiempos de exposición más bajos. Este procedimiento tiene aplicaciones en exámenes farmacológicos, invasión y análisis de migración. Estos enfoques también se pueden emplear para examinar la eficacia de los tratamientos farmacológicos o la dinámica de la motilidad celular.
