Dans les organismes multicellulaires, les tissus affichent des degrés élevés plus loin dans leur orientation spatiale. Les cellules alignent et affichent une gamme de priorités sur de grandes distances au cours de la morphogenèse. Pour comprendre comment les arrangements planaires de l’épithélie sont atteints pendant le développement, il est crucial de suivre les orientations et la dynamique de croissance de la cellule avec une fidélité temporelle spacial élevée in vivo.
Le protocole décrit est conçu pour l’image et l’analyse des comportements cellulaires aux niveaux mondial et local dans l’épiderme pupal drosophile. Cette méthodologie pourrait fournir un aperçu de différentes théories de la recherche, de la biologie cellulaire, de la morphogenèse et de la polarité planaire et peut être appliquée à l’analyse d’autres tissus, structures et modèles. Toutes les étapes peuvent être effectuées facilement après une certaine pratique.
Ils exigent de la précision. La visualisation de ce protocole permet d’obtenir des résultats optimaux dans un délai plus court. La dissection pupale est complexe.
Pour commencer, utilisez un pinceau humidifié pour transférer la prép nymphe blanche mise en scène dans un flacon de plastique frais, et gardez-les là aussi longtemps que nécessaire à 25 degrés Celsius. Ensuite, retirez chaque pupe du mur du flacon à l’aide de forceps. Collez le côté ventral de chaque pupe sur une glissière en verre recouverte de ruban adhésif à double face.
Tapez doucement sur les spiracles de tête et la surface dorsale de la pupe avec les extrémités des forceps pour assurer l’adhérence du boîtier pupal à la bande. Commencez la dissection au microscope stéréo en enlevant doucement l’operculum du puparium avec les forceps. Insérez une pointe des forceps dans un peu profond entre le boîtier pupal et la surface de la pupe par l’ouverture operculaire.
Déchirer le boîtier de la tête à la queue latéralement dans une ou plusieurs balançoires, en évitant de pincer la pupe. Repliez le boîtier pupal fissuré sur les côtés latéraux que vous continuez à procéder à l’extrémité postérieure. Retirez la pupe du boîtier pupal ouvert en insérant soigneusement les forceps sous l’animal et en tirant doucement vers le haut.
La pupe colle à la pointe des forceps. Tenez doucement la pupe par le côté ventral et transférez la pupe dans un plat à fond de verre au-dessus d’une petite goutte d’huile d’halocarbone perméable au gaz. Rouler un morceau de papier de soie humide sur les bords du plat et couvrir le plat pour maintenir l’humidité.
Orientez la pupe sur la goutte d’huile sur les plats à fond de verre selon le domaine et le processus à évaluer. Pour l’imagerie vivante à long terme de l’expansion précoce des nids dorsal, dorsale latéralement orienter la pupe. Pour l’image de leur expansion tardive et le remodelage des tissus, dorsalement orienter la pupe.
Transférer le plat à fond de verre contenant les pupes montées au stade du microscope et se concentrer sur la surface de la zone abdominale à l’aide de la lumière transmise. Pour employer la recombinaison mitotic pour induire des mosaïques génétiques dans l’épithélium abdominal, préparez les femelles vierges portant une flipase inductible de choc thermique, un emplacement de FRT à un endroit génomique spécifique, et un marqueur cellulaire reconnaissable distal au site de FRT. Préparez des mâles mutants portant un site frt à l’endroit génomique équivalent.
Croisez plusieurs femelles et mâles dans une proportion de trois à un dans un flacon en plastique à 25 degrés Celsius pendant quatre à cinq jours. Pour générer des clones somatiques dans les histoblastes, effectuez un traitement par choc thermique au troisième stade larvaire de la progéniture de la croix en arrosant les flacons en plastique contenant les animaux dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes à une heure. Dans le logiciel image J, utilisez la fonction de projection d’intensité maximale pour protéger les tranches de pile Z acquises par microscopie confoccale en 2D.
Les nids ont une forme caractéristique qui les oriente dans un système de coordonnées planaires antérieur à la gauche et dorsale vers le haut. Pour obtenir des résultats optimaux avec cette analyse, l’image d’entrée doit être acquise à haute résolution. Pour obtenir des valeurs d’orientation qualitatives sur les bords des cellules locales, cliquez sur le menu plug-in et choisissez l’option de distribution D d’orientation.
Réglez le sigma de fenêtre gaussienne à un pixel, spline cubique au gradient, cohérence minimale à 20 pour cent, et énergie minimale à un pour cent. Utilisez l’option d’enquête de couleur du plug-in. Réglez la teinte à l’orientation, la saturation à la cohérence, et la luminosité à l’image d’entrée.
Cette couleur code les orientations du bord cellulaire par rapport au système de coordonnées planaires définies. Ensuite, dans le menu plug-in, utilisez l’option de mesure D d’orientation pour quantifier les orientations cellulaires et la cellule directionnelle à l’alignement cellulaire. Générer de petites régions adjacentes non superposées d’intérêt d’un poids uniforme d’environ 20 micromètres fois 20 micromètres dans la zone occupée par les histoblastes.
La mesure de pressage calcule l’orientation locale dominante et la cohérence des ROM. Dans cette étude, la méthodologie utilisée est capable de générer des films à haute résolution des pupes en développement pendant des périodes de jusqu’à 48 heures sans blanchiment photo significatif ou toxicité photo. Des exemples de clones de type sauvage marqués par l’absence de RFP NLS et de leurs taches jumelles à 26 heures après la formation de puparium sont montrés ici.
Les clones se sont allongés le long des limites segmentales. Clones jumeaux disposés en parallèle ou en tandem. La morphologie d’un clone de type sauvage à 26 heures et 47 heures après la formation du puparium montre une morphologie complexe des frontières aux deux stades.
Les parcelles de boîtes et de moustaches pour les paramètres géométriques à 26 heures et 47 heures après la formation du puparium montrent que la zone moyenne et le périmètre ont augmenté de façon significative dans cette fenêtre de temps. L’orientation du clone a été soutenue pendant l’expansion et le remodelage. Les paramètres de forme à 26 heures et 47 heures après la formation de puparium indiquent que la rugosité, la rondeur et la circularité ont à peine changé chez les clones de type sauvage.
Assurez-vous de ne pas endommager la pupe, sinon elle mourra en quelques heures, affectant l’imagerie en direct. Ce protocole n’exige pas l’emploi d’un réaccérable ou d’un instrument sartus. Évitez de vous pincer lors de la dissécation.
En appliquant ces méthodologies possibles pour générer des films à haute résolution pendant de longues périodes en utilisant différentes techniques d’imaginer. Focal sur les disques photons ou filatures. L’analyse chlorale peut être utilisée pour explorer les réponses non autonomes puisque les cellules aléatoires facilitent l’identification des pourparlers croisés ou des mécanismes de communication cellulaire.
Ces méthodes peuvent être facilement adaptées pour étudier une gamme complète de phénomènes morphogenétiques, y compris la coordination du développement épidermique, musculaire et neuro pendant la métamorphose.
