We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education&#160;Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.

1. Dissection de ovarioles <ol><li> Transférer environ quinze 2-4 jours d&#39;âge mouches femelles et quelques hommes d&#39;une mouche des aliments frais flacon avec de la levure sèche active ajoutée. Utilisez le coton comme une prise pour les flacons, et ajouter quelques gouttes d&#39;eau au coton pour maintenir l&#39;humidité élevée. </li><li> Lieu flacon dans un incubateur à 25 ° pour 14-16 h pour maximiser le nombre de l&#39;étape 8-10 chambres d&#39;œufs. NOTE: Le temps d&#39;incubation varie selon la température et stade désiré. </li><li> Préparer les médias de dissection, 0,1 M KPO 4 et NP40 solutions au besoin pour le lendemain (voir Matériaux). </li><li> Anesthésier vol utilisant le CO 2, et le placer sous un microscope de dissection. Pipet quelques gouttes de médias de dissection dans chaque cavité dans la glissière de la dépression de verre. </li><li> Tenez pince dans chaque main à un angle d&#39;environ 30 ° vers le haut de table et orienter une mouche femelle avec les ailes vers le bas. Avec votre main non dominante, ramasser la femelle aide d&#39;une pince, son saisissant à la unenterior de l&#39;abdomen, près du thorax, et son plonger dans les médias de dissection dans la dépression coulisse (figure 1A encadré). </li><li> Avec l&#39;autre paire de pinces, saisir l&#39;exosquelette à la partie postérieure de l&#39;abdomen ventral et percer. Prenez les ovaires à l&#39;extrémité postérieure, puis de les sortir de l&#39;abdomen et le placer dans les médias frais de l&#39;autre côté de la glissière de la dépression. (Figure 1A encadré). Évitez de tirer en dehors de l&#39;intestin. Jeter la carcasse. </li><li> Répéter l&#39;opération avec les autres mouches femelles jusqu&#39;à ce que toutes les ovaires sont disséqués. Jeter les mâles. </li><li> Avec une paire de pinces, maintenez un ovaire à l&#39;extrémité postérieure (près des plus grandes salles d&#39;œufs), et avec l&#39;autre main utiliser une paire de pinces pour pincer l&#39;une des chambres les plus antérieures d&#39;œufs (de germarium). (Figure 1A). </li><li> Lentement mais sûrement, tirer une chaîne ovariole hors de la gaine ovaire. Continuer à disséquer ovarioles individuellement jusqu&#39;à ce que toutes les chambres d&#39;œufs souhaités sont removed. </li><li> Répétez les étapes 1.7 à 1.8 pour toutes les ovaires disséqués. </li><li> Une fois terminé, transférer ovarioles dans un tube de 0,6 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique. </li><li> Laissez ovarioles se déposent au fond du tube, puis passez à fixation et de coloration étapes. </li></ol> 2. immunofluorescence (IF) Coloration des ovarioles <ol><li> Retirez délicatement les médias de dissection de ovarioles avec une pipette. Veillez à ne pas supprimer tous les ovarioles ou chambres d&#39;œufs. Laissez environ 50 pi de ovarioles et les médias de dissection. </li><li> Ajouter 50 ul de 16% de paraformaldéhyde à 150 ul de 0,1 M KPO 4 tampon dans un tube, et ajouter la solution à des chambres d&#39;oeuf pour les corriger. Incuber tout bascule pour 10 min. ATTENTION: paraformaldéhyde est toxique. </li><li> Retirer fixateur et rincer deux fois avec 0,5 ml de tampon de lavage de NP40. </li><li> Laver deux fois pendant 15 min chacune à la température ambiante. </li><li> Reportez-vous à la norme si le protocole 15 pour les étapes suivantes. <ol><li> Brièvement, après fixation, ajouteranticorps primaires aux dilutions appropriées et incuber O / N à 4 ° C. Laver à NP40 à plusieurs reprises, puis ajouter des anticorps secondaires (1: 200 dilutions). </li><li> Lavez plusieurs fois dans NP40, puis ajouter DAPI (1: 1000) pendant 10 min, puis répétez lavages. Une fois que si le protocole est complète, ajouter 200 ul de 50% de glycérol dans du PBS pour chambres d&#39;oeufs et laisser reposer à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Retirer la solution, le remplacer par 70% de glycérol dans du PBS, et couvrir de papier d&#39;aluminium. Placez échantillon à 4 ᵒC jusqu&#39;au moment pour le montage. Pendant ce temps, passez à l&#39;étape 3. </li></ol></li></ol> 3. Préparation préalable de glycérine Jelly Diapositives <ol><li> Mesurer au moins 4 ml de glycérine gelée aide d&#39;une spatule et remplir un tube de culture de cellules de verre pour la marque à mi-chemin. Faire fondre la gelée de glycérine dans un bain d&#39;eau à 55 ° C pendant 30 min. </li><li> Verser une petite goutte de glycérol, environ 300 pi, de la solution de réserve sur deux lames de microscope. Utiliser un tissu, répartis glycérol dans une fine layer sur chacune des diapositives. Ceci fournit une base et permet de retirer facilement la glycérine gelée à l&#39;étape 5.6. </li><li> Coupez la pointe de d&#39;une pointe de pipette 1000 pi filtré. Utilisez copier pointe de la pipette pour transférer 1000-1500 ul de la glycérine chaude gelée lentement à chaque lame de microscope. Prenez soin d&#39;éviter les bulles. </li><li> Laissez diapositives glycérine gelée reposer pendant 5 min à température ambiante à définir. </li><li> Placez chaque diapositive glycérine gelée dans 60 mm × 15 mm plat de Pétri et couvrir d&#39;une pellicule plastique. Lieu à 4 ° CO / N. Eventuellement, magasin glycérine diapositives de gelée jusqu&#39;à 5 jours à 4 ° C. </li></ol> 4. Montage Chambers oeufs <ol><li> En utilisant des échantillons de l&#39;étape 2.5, pipette quelques gouttes 3 pi de chambres d&#39;œufs dans 70% de glycérol dans une diapositive de la gelée de glycérine. Continuer pipetage 3 gouttes ul jusqu&#39;à ce que toutes les chambres d&#39;oeufs sont sur cette diapositive. Assurez-vous que chaque goutte contient au moins dix chambres d&#39;œufs. Pendant ce temps, chauffer un tube de culture de glycérine gelée dans un bain-marie à 55 °. </li><li> Placer la lame de gelée de glycérine avec des chambres d&#39;oeuf sous un microscope à dissection. Ajuster le grossissement de telle sorte que seule une goutte de chambres d&#39;oeuf est dans le champ de vision (figure 1B). </li><li> En utilisant une aiguille de calibre 30 comme une cuillère, ramasser la chambre d&#39;œufs de stade désiré. Si nécessaire, les chambres d&#39;œufs souhaités séparée d&#39;une chaîne de ovariole utilisant l&#39;aiguille comme un couteau. </li><li> Pour éviter les débris qui peuvent interférer avec l&#39;imagerie, transférer la chambre de l&#39;œuf à la deuxième diapositive glycérine gelée, à la face antérieure gauche (figure 1E -1). Répéter jusqu&#39;à ce que il ya au moins sept chambres d&#39;oeuf alignés dans une colonne (figure 1C). </li><li> Former de nouvelles colonnes de sept jusqu&#39;à ce que toutes les chambres d&#39;oeuf désirées sont transférées à la seconde glissière de glycérine gelée. </li><li> Déchirez un petit morceau de tissu et la torsion. Utilisez cette option pour absorber l&#39;excès de PBS-glycérol des chambres d&#39;œufs en effleurant chacun. Prenez soin de ne pas supprimer les chambres d&#39;œufs. </li><li> Coupez lepointe d&#39;une pointe de pipette 200 pi filtré. Utilisez cette option pour transférer 150 pi de glycérine gelée pour couvrir toutes les colonnes de chambres d&#39;œufs. REMARQUE: La quantité de glycérine gelée nécessaire pour couvrir les colonnes est basé sur les étapes de la chambre d&#39;œufs et le nombre de colonnes. Montant peut être ajustée. </li><li> Laissez chambres d&#39;œufs montés reposer pendant 5 min à température ambiante jusqu&#39;à ce que la couche supérieure de la glycérine gelée est complètement solidifié (figure 1D). </li><li> Placer la lame de chambres d&#39;œufs montés dans une boîte de 60 mm × 15 mm de Pétri et couvrir d&#39;une pellicule plastique. Conserver à 4 ° CO / N pour permettre aux couches de gelée de glycérine pour solidifier ensemble (lieu dans l&#39;obscurité se il est préoccupé par photoblanchiment). </li></ol> 5. Préparation des Chambres oeufs for Imaging <ol><li> Placer les lames de chambres d&#39;oeufs montés sous un microscope à dissection. Ajuster le grossissement de telle sorte que seulement une colonne de chambres d&#39;oeuf est dans le champ de vision. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un angle de 45 ° scalpel miniature, couper un Straight ligne le long du côté droit de la première colonne de chambres d&#39;oeuf (à proximité de la face postérieure des chambres d&#39;oeuf). (Figure 1D-E) </li><li> Ensuite, couper au-dessus de la première chambre d&#39;oeuf en haut et en dessous de la dernière chambre de l&#39;oeuf dans la colonne. A ce stade, la colonne de chambres d&#39;oeuf doit être coupée sur trois côtés. </li><li> Utilisation d&#39;un microknife, tranche le long du côté gauche de la colonne, aussi près que possible de la face antérieure des chambres d&#39;oeufs (Figure 1E) -3. </li><li> Introduire à la pipette 100 pi de froid 1X PBT sur la colonne de coupe. </li><li> Utilisez une spatule à bords arrondis pour éliminer l&#39;excès de glycérine gelée autour de trois côtés de la colonne de chambres d&#39;œufs et jetez la coupe, en laissant le reste de la diapositive. </li><li> Insérer la spatule dans la coupe faite à la face antérieure de chambres d&#39;oeuf et séparer la colonne du bloc de glycérine gelée primaire. </li><li> Préparer les échantillons pour les deux inversées (5.8.1) ou verticale (5.8.2) microscopie. <ol><li> Pour microscope inversé: t Transfertil colonne de chambres d&#39;oeufs à une lamelle avec le côté antérieur de chambres d&#39;œufs vers le bas. Répéter les étapes 5.2 à 5.8 jusqu&#39;à ce que toutes les colonnes de la glycérine gelée ont été enlevés et monté. Ajouter quelques gouttes de 50% de PBS-glycérol sur chaque bloc de chambres d&#39;oeuf pour les empêcher de se dessécher. Chambres image d&#39;œufs directement sur la lamelle. </li><li> Pour microscope droit: Transférer la colonne de chambres d&#39;oeuf à une lame de microscope avec le côté antérieur vers le haut. Répéter les étapes 5.2 à 5.9 jusqu&#39;à ce que toutes les colonnes de la glycérine gelée ont été retirés et montés sur des lames de microscope. Ajouter quelques gouttes de 50% de PBS-glycérol sur chaque bloc de chambres d&#39;oeufs et des blocs de couverture avec un ½ lamelle # 1. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

Nous décrivons ici une méthode pour monter et petite image, développer chambres d&#39;œufs dans une perspective de fin sur. Techniques communes pour les chambres imagerie d&#39;œufs sont optimisés pour des vues latérales et permettent principalement la visualisation précise des cellules folliculaires médio-latérale lorsqu&#39;ils sont colorés avec des anticorps fluorescents. L&#39;utilisation de piles ou Z-3-D reconstitutions aides à la visualisation de plusieurs plans focaux, mais est encore insuffisante po...

Etude de Drosophila melanogaster a fourni de grandes connaissances dans la régulation génétique d&#39;un large éventail de phénomènes. En particulier, il ya eu des recherches approfondies sur le développement des œufs, parce oogenèse fournit un moyen souple pour enquêter sur de nombreux processus de développement différents, y compris les motifs des tissus, des changements de polarité cellulaire, la commutation du cycle cellulaire, et la réglementation de translation 1,2,3,4. Un événement important au cours de l&#39;ovogenèse morphogénétique est la spécification, l&#39;acquisition de la motilité et la migration d&#39;un ensemble de cellules appelées cellules frontalières (examinés dans cinq). Depuis la migration cellulaire est un élément clé de la morphogénèse des animaux, et parce que la régulation génétique de ce processus est bien conservé, des mécanismes déterminés mouches sont susceptibles d&#39;être importants dans d&#39;autres contextes. Ainsi, nous étudions le contrôle moléculaire de la migration cellulaire de frontière. Pour nos études, nous avons développé une nouvelle méthode pour observer les pôles antérieurs des œufs en développement,où les cellules se posent aux frontières, d&#39;examiner comment elles se développent en détail. Dans l&#39;ovaire, chambres d&#39;œufs à divers stades de développement existent le long des chaînes appelées ovarioles, qui sont entourées d&#39;une gaine mince (figure 1A). Chaque chambre de l&#39;œuf va se poursuivre pour former un œuf. Au cours de l&#39;ovogenèse, plusieurs types de cellules différents doivent se développer de manière coordonnée. Le D. chambre melanogaster d&#39;oeuf se compose de 16 cellules germinales, dont un ovocyte, entouré par une seule couche de l&#39;épithélium folliculaire 6. Un petit nombre de cellules spécialisées, appelées cellules polaires, se pose au antérieures et postérieures pôles de l&#39;épithélium. Les cellules de bordure 6-8 proviennent de l&#39;épithélium antérieur de la chambre d&#39;oeuf, induite par les cellules polaires 5,7. À la mi-ovogenèse (étape 9), les cellules de bordure se détachent de leurs voisins et migrent entre les cellules nourricières pour atteindre l&#39;ovocyte à la partie postérieure de la chambre d&#39;oeuf 5,7. Ce mouvement doit être accomplietandis que les mailles de bord restent dans un cluster polaires entourant deux cellules non-mobiles, ce qui rend ce type de migration cellulaire collective. Migration réussie de la grappe de cellules de la frontière assure le bon développement du micropyle de la coquille d&#39;oeuf, qui est nécessaire pour la fécondation. Les cellules polaires antérieures instruisent le destin des cellules de la frontière en activant une cascade de transduction du signal. Cellules sécrètent une cytokine polaires, non apparié (UPD), qui se lie à un récepteur transmembranaire, Domeless (DOME), sur les cellules de follicules voisin lors de l&#39;étape 8 de développement des ovocytes 8,9. La liaison de UPD provoque Janus tyrosine kinase (JAK) de phosphoryler le transducteur de signaux et activateur de la transcription (STAT) 8,10,11. STAT se déplace ensuite vers le noyau pour activer la transcription. Cellules frontaliers lents (SLBO) est un facteur de transcription qui est une cible transcriptionnelle directe de STAT et est également requis pour la migration des cellules de la frontière 12. Vues latérales de chambres d&#39;œufs indiquent tactivité de STAT chapeau est réglementée dans un gradient à travers l&#39;épithélium antérieure 8,11,13. Cellules folliculaires proches des cellules polaires ont les plus hauts niveaux de activé STAT, ainsi ils deviennent des cellules frontières et envahissent le tissu de la lignée germinale adjacente. Pour comprendre comment les cellules frontières sont spécifiées à l&#39;intérieur et se détachent de l&#39;épithélium, nous avons besoin d&#39;observer comment le tissu est organisé. Si nous considérons chambres d&#39;œufs dans une perspective antérieure sur, nous nous attendrions à symétrie radiale de l&#39;activité de STAT dans les cellules folliculaires qui entourent les cellules polaires. Une vue en bout serait également montrer avec plus de précision les différences de protéines membranaires et des interfaces cellule-cellule avant et pendant le détachement que de comparer les cellules dans différents plans focaux. Parce que les chambres d&#39;oeuf sont oblongues et fixées les unes aux autres par les cellules de la tige, ils se installent sur des lames latéralement, ce qui rend difficile l&#39;observation de l&#39;architecture antérieure. Ainsi, beaucoup d&#39;informations sur les cellules au niveau des pôles de la chambre d&#39;oeuf aété déduit de vues latérales. Bien que certaines informations peut être obtenue par algorithmiques reconstructions 3-D de sections optiques, diffusion de la lumière, de photoblanchiment, et les limites les plus pauvres de la résolution de l&#39;axe Z rendre cette information moins détaillée et fiable en l&#39;absence de techniques coûteuses comme la microscopie de super-résolution 14 . D&#39;autres types de formation d&#39;image sur la base de l&#39;article (par exemple, la microscopie électronique ou microtome découpe) exigent beaucoup de manipulation de tissus, y compris la déshydratation, ce qui augmente la probabilité pour les artefacts. Ainsi, nous avons développé une nouvelle méthode pour l&#39;image D. chambres melanogaster d&#39;œufs tandis que debout. Cette méthode a déjà fait ses preuves utiles à élucider comment les cellules mobiles sont voués (voir résultats représentatifs et Manning et al, en cours d&#39;examen), et est susceptible d&#39;être plus largement utile dans les études d&#39;autres aspects de l&#39;ovogenèse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:348px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:279px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:283px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:348px;">0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">Add 3.1 g of NaH2PO4&#8226;H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:348px;">16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>methanol-free to preserve GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">30G x 1/2 inch needle&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305106</td>
			<td>Regular bevel</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:279px;">Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten female flies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:279px;">PAA-cell culture company</td>
			<td style="width:119px;">A15-701</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:279px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td style="width:283px;">Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:283px;">5mg/ml stock solution&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:283px;">Added to supplement dissection medium (10%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Glass culture tube</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>47729-576</td>
			<td>14mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glass Depression Slides</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>470019-020</td>
			<td>1.2 mm Thick, Double Cavity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerin Jelly&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microsocpy Sciences</td>
			<td>17998-10</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerol</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB15760</td>
			<td>70% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I3021-500ML</td>
			<td style="width:283px;">(interchangable for Nonidet P-40)&#160; Used in NP40 Wash Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica Fluorescent Stereoscope&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica SP5 Confocal Microscope</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>40x/0.55NA dry objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82027-518</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microknife&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Roboz Surgical Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;">37-7546</td>
			<td>45&#7506; angle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-368</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:348px;">NP40 Wash Buffer</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Added to supplement dissection medium (0.6X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Petridish- Polysterine, sterile</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>60Wx15H mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3813-10PAK</td>
			<td>10 packs of Powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3786-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"> 
			11720018</td>
			<td>With L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td>Used in fluorescent antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3014-500G</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">TRIS-HCL</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB70144</td>
			<td>1M TRIS-HCL, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td style="width:279px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For processing confocal Z-stacks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

upright imaging of drosophila egg chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

La méthode d&#39;imagerie verticale nous a permis de voir directement l&#39;organisation des cellules de l&#39;épithélium folliculaire antérieure à l&#39;étape 8. Un marqueur général pour le destin des cellules du follicule, l&#39;Absent Eyes (EYA) protéine, ainsi que le marqueur d&#39;ADN nucléaire DAPI, a montré même l&#39;expression à travers ce champ de cellules, et ont montré que toutes les cellules ont pu être observés avec des intensités de coloration similaires (figure 2B &quot;).</stron...

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Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imagerie Montant du<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambres d&#39;oeufs

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

7.5K vues.  University of Maryland Baltimore County. The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.