The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

La figure 3 montre un résumé de la procédure expérimentale. 1. Préparation des tissus <ol><li> Pour déterminer les conséquences de l&#39;expression modifiée d&#39;un gène d&#39;intérêt, mis en place la croix suivante en double exemplaire et de maintenir à 25 ° C: UAS-transgéniques (mâles) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (Les femelles vierges) NOTE: Pour obtenir contrôle croix de tissu UAS-lacZ mâles à GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: femelles GFP. β-galactosidase génère pas de défauts dans le comportement des cellules dans la rétine. </li><li> Pour améliorer l&#39;efficacité de transgènes ARNi, croix UAS-ARNi mâles à GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b femelles vierges. REMARQUE: défauts occasionnels dans le comportement des cellules dans la rétine exprimant ectopique DCR-2 ont été observées (données non présentées). Vigilance est recommandé si vous utilisez cette approche. </li><li> Sélus blanc pré-pupes de génotypes appropriés et dans 1,5 ml microtubes. Si les nymphes exprimer DCR-2, sélectionnez pupes soit mâle ou femelle: expression de SAMU-DCR-2, un insert sur ​​le chromosome X, est plus forte chez les hommes. Pupes devrait être sexué à 0 h APF avant la pigmentation de la coque de nymphose - les gonades mâles sont visibles grands globes translucides sur les côtés latéraux de la pupe (environ un tiers de la partie postérieure). </li><li> Incuber microtubes contenant les nymphes, dans une boîte de pointe de plastique propre à 25 ° C. Pour éviter le dessèchement des pupes place un 10 cm 2 morceau de tissu, imbibé d&#39;eau distillée, dans la boîte de pointe. REMARQUE: si l&#39;humidité dans la boîte de pointe devient trop élevée, la coque de nymphose peut devenir détrempé et difficile à disséquer dans les étapes ultérieures. </li><li> Incuber pendant le temps approprié. Pour capturer les comportements cellulaires associés à modeler l&#39;œil, préparer pupes pour l&#39;imagerie à environ 17 h APF, 20 h ou 24 h APF APF. Voir résultats représentatifs pour la discussion sur le moment où les comportements de cellules spécifiques sont mieux observées. </li><li> Placez un morceau de ruban adhésif double face douce sur un plat de dissection Sylgard noir. Placer un côté nymphe, dorsale en place, avec la tête de la pupe adhéré au ruban adhésif double face (figure 1A) .Essayez ne pas adhérer thoraciques et abdominaux régions de la nymphe à l&#39;adhésif double face. Avec des pinces soulevez délicatement et retirer l&#39;opercule pour exposer la tête de chrysalide. Déchirez le long du côté de la coque de nymphose pour exposer la zone autour de l&#39;œil. </li><li> Retirez délicatement la nymphe du ruban adhésif. Si la nymphe reste adhérente, appliquer un petit volume d&#39;eau distillée à la jonction entre la coque de nymphose et la bande à affaiblir l&#39;adhérence. </li></ol> 2. Montage <ol><li> Construire un petit 15 mm 2 trame du papier buvard et percer un trou dans le middlethat est de 5,5 mm de diamètre (figure 1B). Plongez dans l&#39;eau distillée et placer dansle centre d&#39;une lame de microscope. En utilisant une seringue de 30 cc, presser un anneau uniforme de la gelée de pétrole pour entourer le cadre de papier buvard. Assurez-vous que la bague de gelée de pétrole est légèrement supérieure à la largeur de la nymphe et que le diamètre de l&#39;anneau est légèrement inférieure à la largeur d&#39;une lamelle. </li><li> Ajouter une petite perle de gelée de pétrole directement sur ​​la diapositive, dans le trou percé dans le papier buvard (figure 1C) .Carefully organiser la pupe, de son côté, soutenu par le cordon de la gelée de pétrole (figure 1D). </li><li> Déposer une lamelle couvre-objet au-dessus de la bague de gelée de pétrole afin qu&#39;il entre en contact au-dessus de l&#39;épithélium de la neuro-épithélium oculaire (figure 1D). Comprimer doucement la préparation pour sceller la lamelle contre la gelée de pétrole et de générer une petite surface de contact à plat entre la région des yeux pupe et la lamelle. </li></ol> 3. Fluorescence Imaging <ol><li> Image de la préparation de chrysalide en utilisant unmicroscope à fluorescence. Chaque 7 min capture des coupes en série par l&#39;intermédiaire du domaine de la neuro-épithélium apical des yeux, dans la région des jonctions adhérentes. REMARQUE: a) les articles de série appropriés sont généralement 4-5 par z-pile composé de 0,2 um z-étapes. b) Irrégularités dans la topologie de l&#39;épithélium, y compris des bosses et des plis légers, peuvent rendre difficile d&#39;acquérir des images de mise au point des grandes régions de tissu. Alors que l&#39;imagerie, on peut trouver le cadre d&#39;une zone d&#39;intérêt d&#39;être mise au point, et une région voisine d&#39;être out-of-focus. Y compris une petite goutte d&#39;eau distillée entre l&#39;œil et la pupe lamelle peut éliminer certains plis de tissus aigus mais pas la topologie caractéristique légèrement inégale des premières étapes de la morphogenèse des yeux chrysalide. Dans ces cas-échantillonner le tissu en étendant le z-pile de mise au point jusqu&#39;à ce que les tranches sont acquis pour l&#39;ensemble du domaine. c) Capture coupes en série tous les 7 min devrait permettre live-imagerie pour 3-4 heures sans un redu importantsction de l&#39;intensité de fluorescence de GFP qui peuvent compromettre la qualité de l&#39;image. Courts intervalles de temps peuvent réduire la durée totale de l&#39;imagerie. </li><li> Continuer imagerie pour 3-4 heures. Ne utilisez pas de mise au point automatique et la fonction de temps qui est disponible sur de nombreux microscopes à fluorescence, puisque la croissance des pupes et le pompage de l&#39;hémolymphe déplace la position de la rétine et vigilante recentrage est nécessaire tous les 14 à 21 min. NOTE que l&#39;imagerie delà de 4 heures peut ralentir ou bloquer la morphogenèse de l&#39;œil. </li><li> Utilisez un logiciel de déconvolution appropriée pour réduire fond et d&#39;améliorer le contraste des images de section de série. Pour chaque fichier z-pile, procédez comme suit dans le logiciel LAS AF (voir tableau des matériaux): Allez dans le panneau Outils, sélectionnez 3D Déconvolution et cliquez sur Appliquer. </li><li> Générer une image projection maximale (MP) pour chaque fichier de pile déconvolué: Allez dans le panneau Outils, sélectionnez Projection 3D et cliquez sur Appliquer. NOTE: L&#39;algorithme de projection maximale peut échouer à générer un uniformely image focalisée de tissu qui a été échantillonné. Une technique pour l&#39;affûtage des régions hors-focus est décrite dans l&#39;étape 5.2. </li></ol> 4. Post-imagerie nymphe de sauvetage et de vérification phénotype <ol><li> Pour examiner si des artefacts ont été introduits ou la pupe lésés lors de l&#39;imagerie, retirer délicatement la nymphe de la plate-forme d&#39;imagerie: l&#39;aide de pinces supprimer la lamelle et de transférer la nymphe dans un flacon propre de la nourriture. Entreposer à la température ambiante ou 25 ° C jusqu&#39;à ce que la mouche adulte émerge. </li><li> Examiner attentivement le phénotype de l&#39;œil adulte et comparez les yeux de mouches adultes émergents de la croix de mouche d&#39;origine. </li></ol> 5. Traitement d&#39;image <ol><li> Alignement automatique de l&#39;image: NOTE: Le tissu vivant Drosophila se déplacera et se développer tout au long du processus d&#39;imagerie. Par conséquent, les centres d&#39;images recueillies à des moments successifs peuvent ne pas correspondre au même point dans le tissu drosophile. En outre, ledisque entier rétinienne tourne environ 30 ° entre ~ 21 et 23 h APF. Pour mettre en évidence les comportements cellulaires individuels et réduire les distractions causées par la croissance organismal, aligner chaque image.While MP cela peut être effectué manuellement, le logiciel de retouche d&#39;image utilisée ici (voir le tableau des matériaux) a algorithmes intégrés qui peuvent accélérer le processus. <ol><li> De l&#39;onglet Fichier du menu principal, Scripts ouvertes et sélectionnez Fichiers de charge dans la pile. </li><li> Importez les fichiers d&#39;image MP dans le panneau Calques de charge et sélectionnez OK. Assurez-vous que la tentative l&#39;option Source Images à aligner automatiquement ne est pas sélectionnée. NOTE: Si cette option est sélectionnée, le logiciel peut utiliser un algorithme d&#39;alignement qui fausse les données d&#39;image. </li><li> Une fois tous les fichiers MP ont chargé dans le panneau Calques, assurez-vous que toutes les images sont dans l&#39;ordre chronologique de telle sorte que le point de temps plus tôt est au sommet de la pile de couches. Si les couches ne sont pas dans le bon ordre, faites glisser et déposez-les jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient commandéscorrectement. </li><li> Sélectionnez Alignement automatique des calques dans l&#39;onglet Modifier du menu principal. Choisissez Repositionner et cliquez sur OK. </li><li> Si l&#39;algorithme Auto-Align ne parvient pas à orienter les cadres à un point focal pertinent, faire des ajustements mineurs à l&#39;aide de l&#39;outil Déplacer. </li></ol></li><li> Affûtage Composite: REMARQUE: les régions hors de mise au point d&#39;une image initiale de MP peuvent être affûtées par «culture» de la pile déconvolué correspondant dans le logiciel LAS AF. Rognage d&#39;un fichier de pile permet de restreindre manuellement l&#39;intervalle d&#39;une pile-z qui est soumise à l&#39;algorithme de projection maximum. <ol><li> Recherchez la fonction de la culture dans le panneau Outils (sous l&#39;onglet Processus). Restreindre manuellement les tranches initiales et finales de telle sorte qu&#39;ils se étendent seulement la courroie d&#39;adhérence dans la région initialement hors-foyer. Cliquez sur Appliquer pour générer un nouveau fichier de pile qui est optimisé pour cette région. </li><li> Générer une nouvelle projection maximale de la pile optimisé localement et l&#39;exportation sous forme de fichier TIFF. </li><li> En ee logiciel de retouche d&#39;image (voir le tableau des matériaux), des scripts ouverts (située dans l&#39;onglet Fichier du menu principal) et sélectionnez Charger des fichiers dans la pile. </li><li> Importez le fichier d&#39;image de député initiale et fichier MP optimisée localement pour un point de temps particulier dans le panneau Calques de charge et sélectionnez OK. Assurez-vous que la tentative l&#39;option Source Images à aligner automatiquement ne est pas sélectionnée. </li><li> Sélectionnez les deux couches dans les couches volet puis choisissez Fusion automatique des calques (situé dans l&#39;onglet Modifier du menu principal) pour masquer automatiquement les régions appropriées des deux images, ce qui donne un uniforme de mise au point de la rétine domaine. Enregistrer l&#39;image composite d&#39;un fichier TIFF. </li><li> Répétez les étapes 5.2.1 à travers 5.2.5 pour toutes les images MP sous-optimales. </li></ol></li><li> Corrections supplémentaires: rotation, recadrage, et ajustez les niveaux des couches film: <ol><li> Avec toutes les couches sélectionné, utilisez l&#39;outil Transformation (Edition&gt; Transformation) pour faire pivoter les images de sorte que l&#39;axe dorso-ventrale de la rétine est alignéà l&#39;axe Y du cadre du film. </li><li> Si nécessaire, utilisez l&#39;outil Recadrage de réduire le champ de vision d&#39;une taille et la forme souhaitées. </li><li> Utilisation ajustement de niveau (de trames individuelles) pour aider à améliorer le contraste entre la membrane cellulaire et le corps de la cellule. </li><li> Pour des raisons de style et de souligner les comportements de cellules spécifiques, introduire des fausses couleurs pour souligner les points d&#39;intérêt dans chaque trame. </li></ol></li><li> Animation: convertir les images dans un film: <ol><li> Ouvrez le volet de l&#39;animation dans l&#39;onglet Windows du menu principal. Sélectionnez faire des cadres à partir de couches dans le menu situé dans le coin supérieur droit de la fenêtre d&#39;animation. </li><li> On notera que les couches sont ajoutés à la sous-fenêtre d&#39;animation dans un ordre séquentiel en commençant par le bas de la pile. Pour inverser l&#39;ordre des images, sélectionnez d&#39;abord tous les cadres et sélectionnez Inverser les images dans le menu Animation volet-là. </li><li> Sélectionnez un temps de retard de trame pour chaque trame en utilisant le menu déroulant ci-dessous le cadre pouceongle. NOTE: Le retard de trame pour Films 1-4 présentée dans cet article est de 0,8 sec. </li><li> De l&#39;onglet Fichier du menu principal, ouvert Exporter et sélectionnez Rendu vidéo. Choisissez exportation QuickTime sous Options de fichier et sélectionnez un format vidéo de votre choix. Sous Options de rendu mis Frame Rate Personnalisé, entrez un taux de 15 de trame, et cliquez sur Rendu. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

La description du développement de type sauvage (ci-dessus) constitue la base pour les comparaisons d&#39;événements de structuration dans ARNi ou des génotypes de surexpression. Les comparaisons de développement direct de tissu sont très précieux pour déterminer précisément quels comportements cellulaires sont réglementés par une protéine d&#39;intérêt. En outre, et non décrit ici, imagerie des cellules vivantes permet de faire une des descriptions qualitatives et / ou quantitatives sur le rôle d&#39;u...

Le composé de Drosophila yeux est caractérisée par la disposition de ses stéréotypé ~ 750 ommatidia séparés par un treillis en nid d&#39;abeilles de cellules de pigment accessoire 4,5. Ces cellules pigmentaires sont modelés par une combinaison coordonnée d&#39;événements: les mouvements de cellules locales, la croissance cellulaire, les changements dans la forme des cellules et l&#39;apoptose. La visualisation en direct de cet épithélium permet d&#39;étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces événements dans un contexte tridimensionnel physiologiquement pertinente et imperturbable. Contrairement aux protocoles précédents 6,7, la technique décrite ici comprend un procédé efficace pour la stabilisation de mouvement de tissu étranger qui ne peut pas être désaccouplé du processus d&#39;imagerie. Cette méthode améliore les études de comportement des cellules dans le développement de la drosophile épithélium pupe des yeux - un tissu qui se développe, tourne, et les changements au cours de l&#39;imagerie. En outre, la technique de mouvement de stabilisationdécrit ici sera utile pour l&#39;étude des cellules dans d&#39;autres contextes où le mouvement se produit étrangère. Pour visualiser les limites des cellules de la rétine dans le domaine de la drosophile, mouche lignes transgéniques ont été générés qui expriment ubi-DE-Cadherin: GFP ainsi que UAS-α-caténine: GFP sous le contrôle du pilote spécifique de l&#39;oeil GMR-GAL4 3.1. L&#39;utilisation de deux marqueurs membranaires GFP étiqueté permet la visualisation des limites des cellules à la lumière d&#39;intensité plus faible. Cela minimise les dommages des tissus et photoblanchiment sur l&#39;exposition répétée à des longueurs d&#39;onde de haute énergie, permettant taux de trame augmenté et la durée du film. Pour améliorer l&#39;efficacité de transgènes ARNi, UAS-DCR-2 a également été incorporé dans une deuxième ligne de mouche 8. Dans une troisième mise à jour de protocoles précédents, une plate-forme d&#39;imagerie simple qui est facile à assembler dans la plupart des laboratoires est décrite. Cet appareil permet d&#39;éviter l&#39;obligation d&#39;avoir une imagerie spécialisée rig généré par &#39;la boutique de machine »d&#39;une université ou d&#39;un service similaire. Cette plate-forme d&#39;imagerie est similaire à celle utilisée pour l&#39;image d&#39;autres tissus pupes 9,10. Présenté ici est un protocole simple d&#39;imagerie des cellules vivantes qui peut être utilisé pour évaluer directement les événements morphogénétiques qui contribuent à la structuration de l&#39;œil de ~ 17 à 42 h après la formation du puparium (h APF). Plus précisément, ce protocole permet de déterminer les conséquences de la modification de l&#39;expression des gènes au cours du développement de chrysalide.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Processus inhérents à la nymphose Drosophila peuvent changer et de fausser l&#39;épithélium de l&#39;oeil de manière à rendre le comportement de cellules individuelles difficiles à suivre lors de l&#39;imagerie de cellules vivantes. Ces procédés comprennent: la rotation de la rétine, la croissance cellulaire et le mouvement organismal. En outre, des irrégularités dans la topologie de l&#39;épithélium, y compris bosses subtiles et se replie souvent présentés comme la nymphe est préparé pour l&#39;imagerie, font qu&#39;il est difficile d&#39;acquérir des images de mise au point de plus que quelques ommatidies dans un plan focal unique. Le workflow décrit ici remédie à ces questions, ce qui permet une analyse facile de processus cellulaires au cours du développement des pupes des yeux drosophile. Nymphes appropriée à étages sont disposés dans un appareil de formation d&#39;image qui peut être facilement assemblé dans la plupart des laboratoires Ubiquitin-DE-Cadhérine. GFP et GMR-GAL4 axées sur l UAS-α-caténine: GFP sont utilisés pour visualiser les limites des cellules dans l&#39;épithélium oculaire 1 -3. Après déconvolution estappliqué aux images fluorescentes capturées à plusieurs plans focaux, images maximales de projection sont générés pour chaque point de temps et améliorées en utilisant un logiciel de retouche d&#39;image. Algorithmes d&#39;alignement sont utilisés pour stabiliser rapidement le mouvement superflu, qui rend le comportement de cellules individuelles plus facile à suivre.

Live-imagerie de l&#39;oeil pupe est une stratégie efficace pour observer les comportements de cellules qui contribuent à la structuration de la neuroépithélium. Le rôle des protéines spécifiques peut être aisément évaluée par expression de transgènes qui modifient les taux de protéines au cours du développement de l&#39;œil. Pour ce faire, GMR-GAL4 est utilisé pour diriger l&#39;expression du transgène derrière le sillon morphogénétique. Ceci offre l&#39;avantage de ne pas perturber les év...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K vues.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vidéo: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Recherche

Biologie du développement

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Une méthode rapide et efficace de disséquer les ailes Pupal de Drosophila adapté aux Immunodetections ou des analyses par PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Préparation de Drosophila Larval et Pupal Testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, Tissu intact

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...