Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation.

1. Jour 1 Avant de commencer: Une population en santé des mouches doit être maintenu en utilisant des protocoles standard de culture: retirer les adultes à partir de bouteilles ou flacons après 3-4 jours d&#39;oeuf-laïcs et permettre le développement de procéder à une température constante jusqu&#39;à errance 3 e stade larvaire initier nymphose. La transition des larves / nymphes est marquée par la formation de la prénymphes (considéré 0 heures après la formation de puparium-CSA). Nymphes immobiles se distinguent des anciennes nymphes par leur coloration blanche et à partir des larves qui n&#39;ont pas encore commencé nymphose par leur forme oblongue, de forme arrondie et la protrusion des stigmates antérieurs. Vous aurez besoin de: <ul><li> Un pinceau pour la collecte des pupes </li><li> Une chambre humide pour les nymphes de culture: Une boîte de Pétri bordée de serviette en papier mouillé et recouvert d&#39;un papier filtre marquée pour les différents moments de la collecte, le génotype ou le sexe des pupes </li><li> Phosphate 1X saline tamponnée (PBS) pour le lavage des pupes </li></ul> Pupes Collection, la culture et de la tenue <ol><li> Utiliser un pinceau mouillé retirez délicatement 0 HEURES APF pupes dans des flacons de culture / flacons et les placer dans le couvercle de la chambre humide. </li><li> Utiliser le pinceau et du PBS 1X laver délicatement les chrysalides pour enlever les débris de l&#39;affaire nymphe </li><li> Si nécessaire, le tri par sexe des pupes. Les ébauches des gonades de pupes peuvent être utilisées pour trier les sexes. Les primordia mâle gonades sont une paire de disques latéraux translucides facilement vu à travers la cuticule nymphe environ 2 / 3 la longueur du corps 5. Les ébauches des gonades femelles sont plus petites et pas aussi facilement identifiés. </li><li> Placez les pupes dans la position appropriée étiquetés dans la chambre humide et revenir à température constante. Culture au point de temps de développement appropriés. </li></ol> 2. Jour 2: Dissection, la fixation et l&#39;incubation des anticorps primaires Avant de commencer: Vous aurez besoin de: <ul><li> Stéréomicroscope Dissection </li><li> Pinces chirurgicales </li><li> Scalpel chirurgical avec le numéro 11 lames </li><li> Deux de neuf plats et la dépression de verre (produit de Corning # 7220-85) <ul><li> Remplir les puits d&#39;un plat avec du PBS 1X: C&#39;est le plat de rinçage pour le nettoyage des pupes disséqué </li><li> Remplir les puits de second plat avec le tampon de fixation </li></ul></li><li> Chambre humide pour l&#39;incubation d&#39;anticorps. Nous utilisons des boîtes en plastique refermable bordée sandwichs avec du papier absorbant mouillé. </li><li> Tampon de fixation: 1x PBS, paraformaldéhyde à 4%, 0,2% d&#39;acide désoxycholique (pour la perméabilisation) </li><li> Dissection plateforme: lame de microscope clair avec un morceau de scotch double-face adhère à un côté </li><li> PBS 1X </li><li> P100 ou P200 pipeteur </li></ul> Dissection <ol><li> En utilisant une pince délicatement retirer un nymphes à la fois et les placer sur la plate-forme de dissection avec l&#39;extrémité antérieure de la pupe face la plus large largeur de la bande. Si les nymphes sont excessivement humide, d&#39;abord éponger les sécher avec une serviette en papier. </li><li> Avant les nymphes ont complètement adhéré à la bande, utilisez un pinceau à leur poste. </li><li> Autoriser les nymphes à l&#39;air sec et adhèrent à la bande (5-10 minutes) </li><li> Avec le scalpel chirurgical disséquer chaque pupes bilatéralement. Le mieux est accompli avec une seule coupure rapide de l&#39;antérieur à l&#39;extrémité postérieure de la pupe. Si elle est correctement effectuée, la coupe coupera la fois antérieures et postérieures paires stigmates. Disséquer pas plus de 10 pupes à une époque que le lavage et le nettoyage des échantillons est vite nécessaire pour prévenir les dommages aux tissus protéolytiques. </li><li> Utiliser un pinceau, de transférer une petite quantité de PBS 1X à chaque pupes disséqué afin de les décoller de la bande. </li></ol> Nettoyage, la fixation et l&#39;incubation des anticorps primaires <ol start="6"><li> Avec une paire de pinces chirurgicales saisir une moitié individuelle nymphe avant et immédiatement plonger dans un puits de l&#39;antenne de rinçage. La plate-forme de dissection devrait être remplacé par le plat de rinçage sur la platine du microscope. Le cas pupes doivent être laissés sur l&#39;échantillon jusqu&#39;à la fin du traitement et les échantillons sont prêts pour le montage. </li><li> Alors qu&#39;il était encore saisir la moitié nymphe utiliser une pipette doucement laver les tissus internes de l&#39;abdomen. Trop de pression au cours du lavage peut conduire à la perte de cellules épithéliales. </li><li> Transférer immédiatement la moitié propre chrysalide tampon de fixation à la température ambiante et de traiter les moitiés restantes nymphe similaire. Avec la pratique, la dissection et le lavage des moitiés nymphe 20 devrait prendre moins de 5 minutes. </li><li> Autoriser les pupes à incuber dans un tampon de fixation à la température ambiante pendant 1 (un) heures. </li><li> Rincez fixes pupes 3x cinq minutes dans du PBS 1X </li><li> Les échantillons peuvent être immédiatement traitées, pour l&#39;immunohistochimie ou peuvent être conservés dans l&#39;éthanol à 100% à -20 ° C jusqu&#39;à 3 mois sans perte de cellules ou de réactivité épitope. </li><li> Pour stocker des échantillons, des échantillons s&#39;équilibrer grâce à une dilutionsérie de PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) à température ambiante pendant 20 minutes dans chaque dilution avant de transférer jusqu&#39;à 100% EtOH. </li><li> Les échantillons doivent être rééquilibrée en PBS dans la série inverse avant le traitement pour l&#39;immunohistochimie. </li><li> Bloc échantillons dans du PBS 1X (supplémenté avec 2% d&#39;albumine sérique bovine) pour 1 (une) heure avant l&#39;addition de l&#39;anticorps primaire. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire dilué à la concentration appropriée dans du PBS 1X pendant la nuit à 4 ° C sans balancement. </li></ol> 3. Jour 3: l&#39;incubation d&#39;anticorps secondaire, le montage et l&#39;imagerie Avant de commencer: Vous aurez besoin de: <ul><li> Deux pinces chirurgicales </li><li> Supports de montage (glycérol, Vectashield [Vector Labs], ou Slowfade Gold [Invitrogen]) </li><li> Dépression diapositives microscope ainsi (0,8 mm) </li><li> Lamelles (24 x 40 mm) </li></ul> D&#39;incubation d&#39;anticorps secondaire et de montage: <ol><li> Lavez échantillons 3x 10 minutes chacun avec PBS 1x </li><li> Bloc échantillons dans du PBS 1X (supplémenté avec 2% d&#39;albumine sérique bovine) pour 1 (une) heure avant l&#39;addition d&#39;anticorps secondaire. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire dilué à la concentration appropriée dans du PBS 1X à température ambiante dans l&#39;obscurité sans bascule pour 3 (trois) heures. </li><li> Lavez échantillons 3x 10 minutes chacun avec PBS 1x </li><li> Le cas échéant, contre-coloration des pupes (exemple, nous coloration des noyaux au DAPI [4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole] dilué dans du PBS pendant 10 minutes). </li><li> Equilibrer les échantillons (minimum de 30 minutes) dans les médias appropriés avant le montage. </li><li> Préparer une diapositive échantillon. La morphologie de la chrysalide empêche de montage à plat. Les échantillons sont montés dans le puits d&#39;une lame de dépression (glisser-déposer) pour l&#39;imagerie. Placer 75 100 ul de milieux de montage dans la dépression ainsi. Plusieurs échantillons peuvent être montés sur une seule lame. </li><li> Le cas nymphe doivent être retirés à partir des échantillons avant le montage. Saisissez un cas individuel nymphe antérieurement en étant sûr de ne pas saisir la membrane interne chrysalide. </li><li> Avec une deuxième paire de pince délicatement saisir la membrane interne nymphe par la tête et le retirer de la coque de nymphose. </li><li> Immédiatement le transfert de l&#39;échantillon à la dépression ainsi et poursuivre le traitement des échantillons supplémentaires. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une position de la sonde ou pince les échantillons de manière uniforme dans la dépression et à la surface latérale vers le haut. Bulles d&#39;air occasionnels peuvent être enlevés avec une sonde. </li><li> Abaissez délicatement la lamelle sur les échantillons en prenant soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Les échantillons préparés en utilisant ce protocole conserver la morphologie de l&#39;abdomen adulte. Piles d&#39;images peuvent être projetées pour générer une image en deux dimensions ou en 3-D de rendu peuvent être appliquées pour étudier la topologie abdomen. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Segmentation des produits de gènes chez la drosophile pupes protéines Wingless et d&#39;expression Engrailed (EN-GAL4: UAS-GFP). Ont été visualisées au 26 heures après la formation puparium (CSA) avec souris anti-GT (4D4: Iowa hybridomes Bank) et anti-GFP. Grossissement 10x, antérieure est à gauche et dorsale est en place. Noyaux ont été contre-colorées avec du DAPI. Piles d&#39;environ 50 images (Az entre les tranches est 2.5μm) ont été projetés.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les techniques présentées dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer la drosophile pupes d&#39;une variété de points de temps de développement. Pupes traitées pendant la période de 24 heures à 32 heures CSA CSA sont les plus sujettes à la perte de cellules de l&#39;épithélium. L&#39;utilisation de détergents (comme le Triton X-100 et le Tween-20) au cours des étapes d&#39;incubation prolongée augmente le risque de perte de cellules et n&#39;est donc pas recommandé. Au contraire, l&#39;acide désoxycholique est utilisé comme un détergent pendant l&#39;étape de fixation initiale. Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans du PBS 1X sans détergent. En outre, les échantillons à bascule au cours des étapes d&#39;incubation prolongée augmente la perte de cellules et devrait être évitée. Les échantillons peuvent être imagées en utilisant des techniques de microscopie confocale. Toutefois, la drosophile pupes traitées comme décrit peuvent également être visualisés à l&#39;aide d&#39;un système de microscopie à illumination structurée produisant une qualité d&#39;image comparable à celle des techniques confocale.

<ul><li> Stéréomicroscope Dissection </li><li> Pinces chirurgicales </li><li> Scalpel chirurgical avec le numéro 11 lames </li><li> Neuf-même les plats en verre de dépression (Corning produit # 7220-85) </li><li> Chambre humide pour les nymphes culture </li><li> Phosphate 1X saline tamponnée (PBS) </li><li> N ° 11 scalpel chirurgical </li><li> scotch double-face </li><li> Tampon de fixation: 1x PBS, paraformaldéhyde à 4%, 0,2% d&#39;acide désoxycholique (pour la perméabilisation) </li><li> P100 ou P200 pipeteur </li><li> Dépression diapositives microscope ainsi (0,8 mm) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

L&#39;abdomen drosophile nymphe est un système modèle établi pour l&#39;étude de la morphogenèse épithéliale et le développement des maladies sexuellement dimorphique morphologies 1-3. Pendant la nymphose, qui s&#39;étend sur environ 96 heures (à 25 ° C), les populations de cellules proliférantes imaginale des larves de remplacer l&#39;épiderme pour générer des segments abdominaux pour adultes. Ces cellules imaginales, né pendant l&#39;embryogenèse, exister en tant que paires latérales de nids histoblast dans chaque segment abdominal de la larve. Quatre paires de nids histoblast donner lieu à la cuticule adulte dorsale (antérieure et postérieure nids dorsale), la cuticule ventrale (nids ventrale) et les stigmates associés à chaque segment (nids spiracle) 4. Sur puparation, ces cellules diploïdes (reconnaissables à la taille du plus grand des polyploïdes larvaires épiderme des cellules-ESL) d&#39;entamer un processus stéréotypés de la prolifération, la migration et le remplacement des ESL. Différents outils moléculaires et génétiques peuvent être employées pour étudier la contribution des voies génétiques impliqués dans la morphogenèse de l&#39;abdomen adulte. Phénotypes adultes sont généralement analysées ultime de dissection suivante de l&#39;adulte cuticules abdominale. Toutefois, l&#39;enquête sur les processus moléculaires sous-jacents nécessite des analyses immunohistochimiques de l&#39;épithélium nymphal, qui présentent des défis uniques. Temporellement morphogenèse dynamique et l&#39;interaction de deux populations distinctes épithéliales (larvaire et imaginale) génèrent un tissu fragile sujettes à la perte excessive de cellules lors de la dissection et le traitement ultérieur. Nous avons développé des méthodes de dissection, la fixation, le montage et l&#39;imagerie de l&#39;épithélium drosophile abdominem nymphe pour des études immunohistochimiques qui génèrent des échantillons compatibles de haute qualité adapté à la microscopie confocale fluorescente ou standard.

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Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Coloration des anticorps de la<em&gt; Drosophile</em&gt; Pupes peuvent améliorer les analyses génétiques de l&#39;adulte abdominale génétique du développement. Nous présentons notre protocole pour la coloration de la dissection, la fixation et d&#39;anticorps de mise en scène<em&gt; Drosophile</emL&#39;abdomen&gt; chrysalide.

L&#39;immunohistochimie drosophile Abdomen Nymphe

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.2K vues.  University of Alabama. Coloration des anticorps de la Drosophile Pupes peuvent améliorer les analyses génétiques de l'adulte abdominale génétique du développement. Nous présentons notre protocole pour la coloration de la dissection, la fixation et d'anticorps de mise en scène Drosophile

Vidéo: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Sectionnement des préparations minces tranches d&#39;immunohistochimie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Recherche

Biologie

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

Dans le protocole in situ pour Wings Nymphe papillon utilisant ribosondes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunohistochimie: coupes en paraffine utilisant le kit de Vectastain ABC Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

L&#39;immunohistochimie sur coupes en paraffine d&#39;épiderme de souris en utilisant des anticorps fluorescents

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophile larvaire JNM immunohistochimie

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Culture de la drosophile pupes testicule et seul mâle kystes lignée germinale: Dissection, l&#39;imagerie et le traitement pharmacologique

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissection et de montage de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupes disques yeux

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.