This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

NOTE: Un des rendements de souris myoblastes suffisantes pour environ deux boîtes de 35 mm ou deux plats live-imagerie, de sorte que paillassons de plan, la dissection, et revêtement (étape 2.6) en conséquence. Depuis myoblastes sont isolées par centrifugations successives et prédépôt, le protocole doit être effectué par lots de 5 - 10 animaux. Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité d&#39;éthique animale à l&#39;Institut de médecine moléculaire et de l&#39;Université Pierre et Marie Curie 1. Dissection de souris néonatale Muscles des membres postérieurs <ol><li> Préparer toutes les solutions à l&#39; avance (tableau des matériaux) et stériliser par filtration (filtre de 0,22 um). Assurez - vous que tous les médias sont à 37 ° C avant l&#39; addition aux cellules, à l&#39; exception des formulations contenant sous - sol matrice de la membrane (par exemple, Matrigel). </li><li> Stériliser le matériel de dissection (un chacun: des ciseaux courbes, ciseaux droits, pinces régulières,et une pince à pointe fine) et le banc de travail en les essuyant avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Préparer un plat de 100 mm de Pétri avec 5 ml de solution saline tamponnée phosphate de Dulbecco (DPBS) pour la collecte des muscles et de la garder sur la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;étape de hachage. </li><li> Décapitez P6 - souris P8 avec des ciseaux droites et stériliser la peau avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision dans la peau du dos et tirez doucement vers les membres postérieurs jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit retiré, exposant complètement la musculature des membres postérieurs. </li><li> Utilisez la pince pour enlever les tissus adipeux sans endommager les muscles. </li><li> Pour supprimer les muscles dorsaux des membres postérieurs, garder le membre tendu et plier la patte pour exposer les tendons du talon. Utilisez les ciseaux courbes de muscle séparé de l&#39;os, à partir des tendons, en faisant coulisser doucement et coupe vers le haut. Exciser les muscles et les placer dans DPBS glacé. </li><li> Isoler les quadriceps en pinçant le muscle avec une pince à pointe fine et couper autour d&#39;elle, sans endommager le fémur ou l&#39;articulation du genou.</li><li> Après dissection tous les animaux, procéder à une hotte à flux laminaire de culture cellulaire stérile, où toutes les étapes suivantes doivent être effectuées. </li></ol> 2. myoblastes Isolation <ol><li> Retirer l&#39;excès de DPBS. Émincer le tissu avec des ciseaux courbes stérilisées afin d&#39;obtenir une masse uniforme. </li><li> Recueillir le tissu haché dans un tube à centrifuger conique de 50 ml à l&#39;aide de 5 ml de la digestion et de mélange incuber sous agitation à 37 ° C pendant 90 min. </li><li> Mettre un terme à la digestion en ajoutant 6 ml de milieu de dissection et centrifuger la suspension pendant 5 mn à 75 x g pour sédimenter les tissus restants. </li><li> Recueillir soigneusement le surnageant. Assurez - vous de ne pas ramasser les débris de tissu. Centrifuger à 350 g pendant 5 min; remettre en suspension dans 5 ml de milieu de dissection. </li><li> Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 pm. Ajouter 25 mL de milieu de dissection et preplate dans un plat de 150 mm pendant 4 h dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO 2 &lt;/ Sub&gt;) pour permettre les fibroblastes adhèrent. </li><li> Alors que prédépôt, plats manteau avec 500 pi de sous-sol matrice de membrane diluée 1: 100 dans IMDM froid pendant 1 h à température ambiante. Laver une fois avec du DPBS et plaque les cellules immédiatement (étape 2.8) ou à laisser avec un milieu de croissance jusqu&#39;à ce que le placage. </li><li> Après prédépôt, recueillir le surnageant et centrifuger à 350 g pendant 10 min. </li><li> Remettre en suspension dans un milieu de croissance et à compter les cellules sur un hémocytomètre. Réglez le volume de sorte qu&#39;entre 150.000 et 250.000 cellules sont étalées par membrane basale plat de matrice revêtu. Maintenir les cellules dans un incubateur de culture cellulaire. </li></ol> 3. myofibre Différenciation NOTE: Après 3 d, les cellules devraient commencer à fusibles et forment myotubes à environ 70% de confluence (figure 1B). <ol><li> A ce stade, transfecter les cellules, si on le désire, avec un ARNsi ou d&#39;ADN présentant un intérêt. Si les cellules ne sont pas à transfecter, passer directement à un milieu de différenciation et de skip à l&#39;étape 3.4. </li><li> Transfecter avec des réactifs de transfection en suivant les instructions du fabricant. Incuber les cellules pendant 5 h avec des complexes d&#39;ARNsi-lipide (20nm + 1 pl de réactif) ou des complexes d&#39;ADN-lipide (1 pg + 1 pl de réactif). Optimiser les concentrations de siRNA et d&#39;ADN si nécessaire. </li><li> Lavez-les une fois avec un milieu de différenciation, puis passer à nouveau milieu de différenciation. </li><li> Le jour suivant, on dilue la matrice de la membrane basale 1: 2 dans un milieu de différenciation glacée. Retirez le support existant et ajouter 200 pi de matrice glacée à chaque plat. </li><li> Incuber pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Compléter le milieu de différenciation avec l&#39;agrine (100 ng / ml) et on ajoute avec précaution 2 ml aux cellules. </li><li> changer soigneusement la moitié du milieu tous les 2 d, toujours en complétant avec agrine à une concentration finale de 100 ng / ul. </li><li> Surveiller la différenciation cellulaire et la viabilité. En fonction de divers facteurs (tels que FBS et cHicken extrait d&#39;embryon origines), les cellules peut prendre entre 5-10 différenciation d pour atteindre sa pleine maturation (figure 2). </li></ol> 4. immunocoloration en plats à fond de verre <ol><li> Pour immunocoloration, à tout moment, point d&#39;intérêt, laver les cellules une fois avec DPBS et les fixer avec 4% de PFA à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Lavez-les deux fois avec DPBS. À ce stade, les cellules peuvent être conservées à 4 ° C. </li><li> les perméabiliser avec 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Lavez-les deux fois avec du PBS et bloquer avec une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante. </li><li> les Incuber avec l&#39;anticorps primaire dilué dans une solution de blocage O / N à 4 ° C. </li><li> Lavage 3x avec du DPBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> les laisser incuber avec l&#39;anticorps secondaire, et 0,2 pg / ml de DAPI pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Lavage 3x avec du DPBS pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 200 ul de milieu de montage et procéder à l&#39;imagerie. </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

L&#39;utilisation de ce protocole pour la culture des myoblastes primaires donne lieu à un créneau particulier qui nourrit grandement le développement de myofibres. Ceci est partiellement dû à d&#39;autres types de cellules qui sont également présentes en très petits nombres. Un équilibre entre la concentration de myoblastes et la pureté de la culture doit être atteint. Une bonne culture de cellules dépend également de la qualité des produits utilisés pour la formulation de milieu. Tous les produits dérivés d&#39;origine animale doivent être soigneusement testés. Dans notre expérience, les conditions de digestion doivent également être surveillés. Comme d&#39;habitude pour les cultures primaires, la variabilité expérimentale peut être plus élevé que dans les études avec des fibres isolées ou myoblastes immortalisés. Cette variabilité peut être diminuée par la normalisation des moyens et la digestion des composants, des souris âge et la taille, et les points de temps pour la manipulation de la culture et des résultats collection. Néanmoins, l&#39;avantage de scruter en temps réel les mécanismes complexesnécessaire pour le développement de myofibre dépasse largement l&#39;inconvénient de la variabilité. Ce protocole confère les avantages des approches in vitro sans compromettre la différenciation cellulaire. Myofibres matures jusqu&#39;à triades sont formées et les contractions sont couplées à des étincelles de calcium. Ces sorties fonctionnelles sont accessibles dans différentes conditions expérimentales. En outre, il peut y avoir de nombreuses variantes techniques apportées au protocole. Les myoblastes peuvent être récoltées à partir de souris néonatales avec des mutations d&#39;intérêt liés au développement musculaire. Les cellules peuvent être lysées pour une analyse biochimique à différents points de temps de différenciation. Les indicateurs de calcium peuvent être ajoutés à la culture à suivre sa dynamique. constructions optogénétiques peuvent être utilisés pour appliquer certaines voies de signalisation ou d&#39;induire des réponses locales spécifiques. Enfin, les myofibres peuvent être co-cultivées avec des types d&#39;autres cellules pour étudier leurs interactions.

Muscle squelettique compose jusqu&#39;à 40% du poids du corps humain 1. Troubles musculaires associées représentent un immense fardeau sanitaire et économique 2. Comment ce tissu très complexe et organisé est formé, entretenu et régénéré constitue un champ de recherche approfondie et bien établie. En fonction de l&#39;intérêt scientifique particulier, l&#39;approche la plus adaptée peut varier de cultures de myotubes simples à complexes dans des modèles in vivo 3 - 6. L&#39;objectif de ce protocole est de fournir un système in vitro qui permet le suivi de la myogenèse grâce à l&#39; imagerie en direct et immunofluorescence. Par rapport aux approches traditionnelles, ce système offre un aperçu très complet et dynamique dans le processus myogénique de la souris. Les cellules peuvent être suivies à partir du stade de myoblastes à la maturité, myofibres multinucléées affichage triades transversales et des noyaux périphériques 7. Ce niveau de maturation peutêtre réalisé en utilisant un équipement habituel de culture cellulaire, sans nécessiter de dispositifs stimulateurs ou mécaniques complexes. Bien que certains succès dans des systèmes in vitro ont été signalés 8,9, à notre connaissance, ceci est le seul protocole de génération de souris myofibres matures avec T-tubules transversalement jumelé avec réticulum sarcoplasmique (SR). Ainsi, ce système in vitro peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires de la formation triade, qui sont encore mal connus 10. Un autre avantage de ce système réside dans la disponibilité des ressources de souris ciblées validées, telles que des anticorps, des médicaments et des outils d&#39;ARNi. Le protocole relativement simple ne nécessite pas d&#39;étapes laborieuses, la manipulation hautement qualifiée, ou de l&#39;équipement coûteux et dédié. Myofibres échues commencent à apparaître après 5 d de différenciation de culture 7, affichant la contractilité couplé avec des étincelles de calcium (données non publiées). En une semaine, le développement différental étapes de l&#39; une des cellules les plus complexes dans le corps d&#39;un mammifère peuvent être étudiés en combinaison avec une variété d&#39;essais in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase&#160;type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM, Glutamax supplemented</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31980022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth reduced factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be &#60;1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP biomedical</td>
			<td>2850145</td>
			<td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant rat agrin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>550-AG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>11581831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>used to transfect siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>used to transfect DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668030</td>
			<td>used to transfect siRNA plus DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>Science Services GmbH</td>
			<td>E15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 200ng/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			5 mg/ml collagenase 
			3.5 mg/ml dispase 
			sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			10% FBS 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			20% FBS 
			1% Chicken Embryo Extract 
			1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			2% Horse Serum 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			10% Goat Serum 
			5% BSA 
			add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

Les muscles squelettiques sont composés de myofibres, les plus grandes cellules dans le corps d&#39;un mammifère et l&#39;un des rares syncytia. Comment les structures complexes et évolutives conservées qui le composent sont assemblés toujours sous enquête. Leur taille et physiologiques caractéristiques limitent souvent les applications de manipulation et d&#39;imagerie. La culture des lignées de cellules immortalisées est largement utilisé, mais il ne peut se répliquer les étapes précoces de la différenciation. Ici, nous décrivons un protocole qui permet une manipulation génétique aisée des fibres musculaires provenant de myoblastes de souris primaires. Après une semaine de différenciation, les myofibres affichent contractilité, alignés sarcomères et les triades, ainsi que des noyaux périphériques. Le processus de différenciation complète peut être suivie d&#39;imagerie en temps réel ou immunofluorescence. Ce système combine les avantages de l&#39;existant ex vivo et dans des protocoles in vitro. La possibilité de transfection facile et efficace, ainsi quela facilité d&#39;accès à tous les stades de différenciation élargit les applications potentielles. Myofibres peut ensuite être utilisé non seulement pour répondre aux questions de la biologie du développement et de cellules pertinentes, mais aussi de reproduire phénotypes de la maladie musculaire pour les applications cliniques.

La mesure du développement des fibres musculaires est essentiellement déterminée par la pureté et la viabilité des myoblastes isolés. L&#39;adhérence, la prolifération et la capacité de fusion peut être utilisé pour accéder à ces paramètres de façon empirique (figure 1 A, B). À la prolifération D2, les myoblastes auraient adhéré et devraient afficher la forme typique fusiforme. Prolifération devrait se produire largement à ce stade, ce qui conduit à la formation de myotubes spontanée le jour suivant (figure 1B). Cellule de confluence pourrait avoir besoin de légers ajustements. Il devrait être augmenté si les myoblastes prennent plus de 3 d à proliférer et fusible. Il devrait être diminuée si myofibres ne sont pas autorisés à croître et allongé relativement simple en raison de leur densité. Confluence diminue généralement depuis le centre jusqu&#39;à la périphérie de la coupelle, de sorte que les meilleures fibres musculaires doivent être trouvées vers les régions externes. Myotubes vont rapidement allongée et affichage multiple de noyaux alignés au centre (Figure 1C). Par D5, certaines cellules commencent à acquérir des striures et en déplaçant leurs noyaux vers la périphérie. Le nombre de myofibres avec des caractéristiques matures augmentera avec le temps, ainsi que d&#39; une épaisseur de cellule (figure 1D). Le degré de différenciation peut encore être observé par immunofluorescence. Myofibres fixes à la différenciation D8 triades présente transversales. Cela peut être confirmé par des composants d&#39;imagerie des T-tubules (DPHR) et le SR (triadine), qui devraient colocalisent les triades (figure 2). La fonctionnalité de myofibres peut être traitée par l&#39;imagerie en direct. De la différenciation D3 partir, les cellules présentent des contractions spontanées. En transfectant un capteur de calcium (par exemple ,., GCaMP6f 11), il est possible d&#39;observer que les contractions sont couplées avec des pics de calcium (Figure 3). Grâce à ce système, nous avons été en mesure d&#39;identifier une voie moléculaire roman qui est perturbée dans les myopathies de centronucléaires et dystrophies myotonique, qui peut donc être une nouvelle cible pour les thérapies moléculaires innovants 7. Nous avons également adapté cette méthode pour étudier le développement de la jonction neuromusculaire (JNM) 12. À travers la co - culture avec la moelle épinière chez le rat explants de moelle, nous avons décrit un rôle dans la formation dynéine NMJ 13. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> Figure 1: Stades de développement de la culture myoblastes. A) À la prolifération D2, myoblastes ont adhéré et ont commencé à proliférer. B) À prolifration D3, une confluence de 60-80% est atteint et commence la fusion de myoblastes spontanément. C) A la différenciation D3, myotubes contenant des noyaux situés au centre sont prédominants. D) De la différenciation D5 partir (par exemple, le jour 8), myofibres commencer présentant des stries et des noyaux périphériques et commencent à épaissir. Barre d&#39;échelle: 50 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> Figure 2: Représentant confocale Image d&#39;un J8 myofibre immunocoloration. A) immunocoloration pour le récepteur de la dihydropyridine (DHPR, panneau supérieur) et triadine (TRDN, panneau du milieu). Une superposition des canaux DHPR, TRDN et DAPI montre colocalisation des composants de la triade. B)<html> Un profil d&#39;intensité de la ligne jaune tracée dans A. C) Une image 3D de rendu de volume de myofibres colorées pour α-actinine (vert) et DAPI (bleu). Barre d&#39;échelle et de la grille largeur: 5 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> Figure 3: Imagerie en direct des niveaux de calcium dans myofibres avec Spontaneous Twitching. A) haute vitesse time-lapse (trames de 20 ms) la microscopie d&#39;une étincelle de calcium dans un myofibre de secousses. Le calcium a été détectée par l&#39;expression de GCaMP6f (Addgene plasmide # 40755). B) Quantification de l&#39;intensité de la fluorescence au cours du temps pour le capteur de calcium dans le panneau A._blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

In Vitro Différenciation des myofibres matures pour l&#39; imagerie en direct

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

in-vitro-differentiation-of-mature-myofibers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K vues.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Vidéo: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...