De nombreux protocoles existent pour isoler les myofibers simples des muscles squelettiques des souris adultes. Notre protocole est conçu pour les souris très jeunes et pour les petites souris avec un myofibers très fragile. Cette procédure normalisée peut être utilisée pour étudier les cellules souches musculaires assistées par myofiber pendant le développement postnatal ou dans les modèles muraux de maladies qui rendent les myofibers particulièrement sensibles au stress mécanique.
La procédure sera démontrée par Gloria Pegoli, doctorante, et Federica Lucini, post-doctorat, toutes deux d’un laboratoire. Pour la dissection musculaire et la récolte, utilisez une épingle pour fixer un membre postérieur d’une souris euthanasiée, très jeune ou très petite sur une planche de dissection, et utilisez des pinces pointues pour soulever le tendon inférieur de la hauteur antérieure de tibialis à la cheville. Coupez le tendon et utilisez de fines ciseaux pour couper tout autour du muscle au tendon au niveau de la rotule.
Placez le muscle dans un tube de solution de digestion et soulevez le tendon inférieur de l’extenseur digitorum longus, tirant doucement vers le haut sur le tendon pour séparer le digitorum longus extenseur des autres muscles. Coupez et récoltez le muscle. Faites pivoter la jambe pour voir les muscles du dos et soulever le tendon d’Achille.
Un muscle gastrocnemius se séparera automatiquement des autres muscles. Couper le tendon supérieur à l’arrière de la rotule et placer le muscle dans la solution de digestion. Soulevez le tendon externe de la jambe et roulez les pinces sous le tendon pour séparer doucement le tendon du muscle.
Ensuite, coupez pour récolter le muscle et recueillir les mêmes muscles de l’autre jambe de la même manière. Lorsque tous les muscles ont été recueillis, placez le tube de collecte dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 45 à 50 minutes et inversez vigoureusement le tube 10 fois toutes les 10 minutes. Lorsque les muscles commencent à se desserrer et que les myofibers deviennent visibles, secouez les échantillons une dernière fois avant de transférer soigneusement la suspension de digestion dans une boîte Petri préchauffée ou recouverte de sérum de 100 millimètres contenant 10 millilitres de solution de lavage.
Pour isoler les myofibers simples, placez le plat sous un microscope disséquant et utilisez un sérum de cheval enduit de tuyautte de 200 microlitres pour démonter les fibres musculaires individuelles. Transférer les myofibers viables dans un sérum de cheval recouvert de 35 millimètres de boîte petri contenant cinq millilitres de solution de lavage préchauffée. Lorsque tous les myofibers viables ont été prélevés, équilibrer les échantillons de myofiber dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq minutes.
Si plus de myofibers sont nécessaires, utilisez une pipette en verre à gros alésage pour triturer l’échantillon de tissu musculaire restant jusqu’à ce que des fibres supplémentaires soient libérées mécaniquement. Lorsque suffisamment de myofibers ont été recueillis, placez le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure pour une période d’équilibrage supplémentaire. À la fin de l’incubation, transférer les myofibers individuels dans un nouveau plat recouvert de sérum de cheval préchauffé contenant le milieu de culture approprié et remettre l’assiette à l’incubateur de culture cellulaire.
Pour une analyse immunofluorescente des myofibers, après liaison croisée, enlever tout sauf assez supernatant, de ne pas enlever les fibres et ajouter au même tube un millilitre de 0,5%Triton X-100 dans PBS pour une incubation de cinq minutes avec agitation douce. À la fin de l’incubation, laisser les fibres se déposer pendant cinq minutes avant de remplacer le supernatant par 1,5 millilitres de PBS. Après cinq minutes d’agitation douce, laisser les fibres se contenter pendant encore cinq minutes avant de remplacer le supernatant par un millilitre de solution de blocage.
Après une heure d’agitation douce, remplacez la solution de blocage par une solution de blocage fraîche contenant des anticorps primaires d’intérêt pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius par une légère agitation. Le lendemain matin, lavez les fibres avec trois lavages de cinq minutes en un millilitre de 0,25 % de Tween 20 en PBS en utilisant une agitation douce et cinq minutes de sédimentation à température ambiante pour le lavage. Après le dernier lavage, étiqueter les fibres avec les anticorps secondaires conjugués fluorochrome appropriés dilués dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante avec agitation douce, protégé de la lumière, suivie de trois lavages en PBS plus 0,1%Tween, protégé de la lumière, comme démontré.
Après le dernier lavage, remplacer le supernatant par un millilitre de solution DAPI pour une incubation de cinq minutes à température ambiante par une agitation douce, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les fibres et utiliser une pipette enduite de solution de blocage avec une pointe coupée pour recueillir les fibres et étendre soigneusement les fibres sur une glissière en verre. Placez la lame sous un microscope disséquant, et en utilisant seulement la lumière naturelle réfléchie par le miroir, utilisez une nouvelle pointe de pipette de 200 microlitres pour étendre doucement les fibres et enlever la solution excédentaire.
Après avoir enlevé la solution excédentaire, laissez sécher la glissade dans l’obscurité pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un très petit volume de solution. Ensuite, ajoutez un volume approprié de milieu de montage sur les fibres avant de placer soigneusement un glissement de couverture sur les tissus. Pour récupérer un nombre suffisant de fibres longues et viables qui peuvent survivre 96 heures dans le milieu riche en facteur de croissance, quatre muscles différents sont généralement récoltés et digérés.
Seules les fibres les plus intactes doivent être transférées au milieu de culture. Les fibres cassées et autres débris doivent être jetés. Après 72 heures de culture, les cellules satellites activées génèrent des agrégats cellulaires liés au myofiber.
Nous observons que la culture cellulaire est dérivée du delta de Lamin huit 11 souris doubles négatives sont formées par un plus petit nombre de cellules. Après 96 heures, les cellules satellites expriment MyoG, deviennent visibles dans le cluster cellulaire, initiant la différenciation vers de nouveaux myofibers. Notamment, une dynamique retardée de différenciation des cellules satellitaires est observée chez les souris mutantes homozygotes lamin knockout par rapport à leurs homologues de type sauvage.
Assurez-vous de pratiquer les étapes de dissection musculaire comme une récolte musculaire rapide et précise est essentielle au succès de l’expérience. Cette technique permet le suivi des cellules satellites individuelles lors de l’activation et de la différenciation, facilitant l’étude des processus clés sous-jacents à la croissance et à la régénération musculaires dans différentes conditions physiologiques et pathologiques.
