Le développement d’outils sélectifs d’administration de gènes et de médicaments pour traiter les troubles neurodégénératifs nécessite la quantification et la caractérisation du ciblage cellulaire, lors de la ré-administration, ou des vecteurs viraux, ou des nanoparticules. Ils ont des capacités de débit et de multiplexage de cytométrie d’écoulement, permet l’identification directe et simultanée de plusieurs types de cellules à partir du cerveau de la souris et de la moelle épinière. Francisco Javier Molina Estevez, post-doc du Laboratoire Alexander, démontrera la procédure.
Après avoir récolté le cerveau et la moelle épinière d’une souris C57 Black 6 de huit semaines, placez les tissus dans des puits individuels d’une plaque de six puits, contenant deux millilitres de HPSS glacé par puits sur la glace. Diviser chaque tissu récolté en deux morceaux égaux. Et utilisez des ciseaux pour hacher la moitié de chaque échantillon de tissu en morceaux d’un à deux millimètres d’épaisseur.
Lorsque tous les tissus ont été fragmentés, pré-rincer une pointe de pipette modifiée de 1 000 microlitres dans le HPSS, et utiliser la pipette pour transférer chaque suspension tissulaire dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Rincez les puits avec deux millilitres supplémentaires de HPSS par puits. Et tirez les lavages dans les tubes coniques correspondants de 15 millilitres.
Sédimenter les échantillons par centrifugation. Et mélanger 50 microlitres d’enzyme P à partir d’un kit de dissociation des tissus neuronaux avec 1900 microlitres de Buffer X à partir du kit par échantillon. Réchauffer le mélange d’enzymes à 37 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.
Et aspirer le surnatant de chaque tube de collecte de tissus. Lorsque le mélange enzymatique est prêt, ajouter 1,95 millilitres de la solution à chaque échantillon. Et doucement vortex pour re-suspendre les granulés.
Ensuite, incuber les échantillons sur une roue pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, et mélanger 10 microlitres d’enzyme A avec 20 microlitres de tampon Y par échantillon. Pré-guerre de la deuxième solution enzymatique à 37 degrés Celsius, avant d’ajouter 30 microlitres de la solution à chaque solution tissulaire à la fin de l’incubation secouant. Utilisez une pointe de pipette de 1000 microlitres, pré-rincée avec hpss pour mélanger doucement chaque échantillon.
Et remettre les spécimens à la roue pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, arrêtez les réactions enzymatiques avec 10 millilitres de HPSS glacé. Et sédimenter les échantillons par centrifugation.
À la fin de la centrifugation, suspendre à nouveau les granulés en sept millilitres de HPSS glacé par tube. Et vortex doucement chaque échantillon, avant de tenir les tubes sur la glace. Pour l’homogénéisation tissulaire, ajouter trois millilitres de HPSS pré-réfrigéré au mortier de verre pré-refroidi d’un broyeur de tissu dounce, et transférer la deuxième moitié de l’un des échantillons récoltés de cerveau ou de tissu médullaire au mortier.
Macérer délicatement le tissu avec 10 coups de pilon A, suivi de 10 coups de Pilon B.Et transférer le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Remplissez le tube à un volume final de 10 millilitres avec hpss pré-refroidi pour centrifugation. Et re-suspendre la pastille en sept millilitres de HPSS frais avec vortex, avant de tenir l’échantillon sur la glace.
Pour l’enlèvement des débris, ajouter trois millilitres de solution percoll isotonique pré-refroidie à chaque échantillon digéré ou homogénéisé. Et vortex doucement les échantillons pour s’assurer qu’ils sont homogènement mélangés. Ensuite, centrifugez les échantillons, et retirez soigneusement le disque blanchâtre des débris et de la myéline flottant à la surface de la solution.
Lorsque les débris ont été jetés, recueillir tous sauf les 100 derniers microlitres du supernatant de chaque tube sans déranger les granulés. Suspendre à nouveau chaque granulé dans un millilitre de solution FACS BL pour le transférer dans des tubes de microcentrifugeuse individuels de 1,5 millilitre. Après cette intégration avec la solution Percoll, il est important d’enlever le disque de débris et le supernatant très soigneusement sans déloger la pastille cellulaire pour éviter la perte d’échantillon.
Après centrifugation, aspirez soigneusement le supernatant de chaque tube et suspendez les granulés dans 350 microlitres de FACS BL frais par tube. Pour l’analyse cytométrique du débit des types de cellules isolées, incuber les échantillons avec cinq microgrammes par millilitre de bloc FC par tube pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avant d’ajouter l’anticorps approprié à chaque tube selon le protocole permanent décrit dans le tableau. Vortex chaque tube pendant cinq secondes pour mélanger.
Et placez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec un millilitre de PBS par tube et une centrifugeuse. Suspendre à nouveau les granulés dans le volume approprié de streptavidine par tube.
Après vortex pour mélanger, incuber les échantillons pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius protégés de la lumière. Et laver les cellules avec un millilitre de PBS par tube comme démontré. Après avoir jeté les supernatants, suspendre à nouveau les granulés dans 300 microlitres de FACS BL frais par tube.
Et étiquetez chaque échantillon avec cinq microlitres de 7-AAD. Rangez ensuite les échantillons à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse cytofluorométrique. La méthode d’homogénéisation produit un rendement cellulaire plus élevé à la fois du cerveau et de la moelle épinière dans son ensemble, mais la majorité des cellules récupérées sont généralement mortes, ce qui entraîne seulement et environ 14% guéri des cellules viables du cerveau, et environ 10% guéri de la moelle épinière.
En revanche, la méthode de digestion de papain a comme conséquence une meilleure conservation globale de la viabilité cellulaire. L’analyse des suspensions de cellules du cerveau et de la moelle épinière avec une cytométrie bi-flux de neuf couleurs, révèle la présence de CD45+CD11b+microglia, et de macrophages. Et CD45+CD11b-lymphocytes dans les deux tissus.
Les populations de cellules CD45 peuvent alors être discriminées en fonction de leur positivité pour les astrocytes, ou marqueurs oligodendrocytes, ou de l’expression ferionale et endothéliale des marqueurs de surface. En utilisant la méthode d’homogénéisation, entre 32 et 38% des cellules viables sont d’origine hématopoïétique. Alors que la méthode de digestion enzymatique entraîne l’acquisition d’une très grande fraction d’un CD45 non hématopoïétique.
Remarquablement, cd45+CD11b+microglia et macrophages représentent la fraction cellulaire viable la plus abondante avec la méthode d’homogénéisation. La méthode de digestion, cependant, produit une représentation plus hétérogène des types de cellules comprenant des astrocytes, des oligodendrocytes, des cellules endothéliales, et des neurones. Ce protocole est polyvalent et pourrait être exploité pour plusieurs applications en aval telles que la quantification ou l’isolement de sous-populations de cellules spécifiques, la culture primaire ou l’analyse biochimique ou de séquençage de l’ARN.
Nous avons mis en œuvre ce protocole pour évaluer l’expression génétique et les signatures fonctionnelles des différentes populations de SNC au cours de cette progression, ou après traitement dans un modèle muriaque de sclérose latérale endotrophique.
