Ce protocole décrit une culture des cellules intestinales fœtales de souris qui est la mieux adaptée pour atteindre la maturation au stade adulte in vitro. Cette approche in vitro peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de la transition du lait au sevrage ainsi que les modulateurs de ce processus et pour parvenir à une utilisation plus efficace des animaux expérimentaux. Il est essentiel pour ce modèle in vitro de maturation intestinale d’utiliser les cellules intestinales primaires à partir du stade de développement tardif, entre le jour embryonnaire 18 et 20.
Avec deux petits forceps, étirer l’intestin. En utilisant l’estomac et l’appendice comme guides, couper les parties proximales et distales de l’intestin grêle. En utilisant l’appendice comme guide, couper le côlon en morceaux.
Pour rendre l’intestin ouvert longitudilement, placez une lame de rasoir dans le sens de la longueur le long de l’intestin et tirez l’intestin en glissant des forceps le long de la lame de rasoir. Par la suite, couper l’intestin ouvert en morceaux d’un centimètre. Préparer trois tubes de 50 millilitres avec dix millilitres de PBS glacé.
Transférer les parties proximales et distales de l’intestin grêle et du côlon séparément dans les tubes. Gardez les tubes sur la glace tout en disséquant les intestins de souris supplémentaires. Recueillir toutes les parties intestinales d’une portée ensemble dans le même tube.
Après avoir lavé les morceaux intestinaux avec du PBS glacé, incuber avec deux millimolaires EDTA pendant 30 minutes. Pour dissocier les cryptes du tissu, lavez partiellement les morceaux avec du PBS glacé et du sérum de veau à dix pour cent et filtrez à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un nouveau tube. Répétez le lavage du tissu deux fois de plus et combinez la solution filtrée.
Centrifugeuse la solution filtrée contenant les cryptes à 150 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir les cryptes comme une pastille. Transférer à nouveau les cryptes dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse. Pour plaquer les puits, ajouter la quantité totale de gel matriciel extracellulaire nécessaire dans le tube et dissoudre la pastille.
Ajouter 20 microlitres des cryptes dissoutes dans chaque puits d’une plaque chaude de 48 puits. Après le placage du premier puits, regardez au microscope pour confirmer la densité d’environ 250 à 300 cryptes par puits. Placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant dix minutes pour laisser le gel matricielle extracellulaire se solidifier.
Ensuite, préparez le support ENR. Ajouter 250 microlitres du milieu ENR dans chaque puits sur le gel. Changer le milieu trois fois par semaine et passer les organoïdes une fois par semaine.
Pendant un mois, tous les trois jours après chaque passage, analyser la culture. Trois jours après chaque passage, isoler l’ARN d’un puits en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse d’ARN complétés par deux microlitres de bêta mercaptoéthanol au puits. Ensuite, transférez l’échantillon du puits dans un tube de 1,5 millilitre sans RNAse.
Dans nos expériences in vitro, nous avons utilisé la dexaméthosone comme un exemple d’un facteur externe qui est connu pour accélérer la maturation intestinale in vivo. Pour isoler les protéines, ajoutez 250 microlitres de solution de récupération des cellules glacées par puits à cinq puits d’organoïdes et recueillez-les tous dans un tube de 15 millilitres. Incuber pendant au moins 30 minutes sur la glace pour dissoudre le gel matriciel extracellulaire.
Laver avec du PBS glacé, ajouter 250 microlitres de tampon de lyse cellulaire et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Pour analyser l’activité enzymatique, préparez d’abord 0,625 tampon maleique molaire au pH six et 0,05 solutions molaire de lactose, saccharose, maltose et tréhalase et conservez-les sur de la glace. Préparez des normes d’analyse en diluant la solution de glucose molaire de 5,56 avec de l’eau ultra-pure pour obtenir des solutions avec 5 concentrations différentes.
Puis, dans une plaque de 96 puits, ajouter huit groupes différents de lysate organoïde avec leurs substrats respectifs, y compris les normes et le contrôle selon le manuscrit. Incuber pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius. Pour déterminer la quantité de glucose produite par les enzymes présentes dans le lysate organoïde, ajoutez rapidement 200 microlitres de solution de couleur PGO fraîchement préparée et mesurez l’absorption sur le spectrophotomètre à 450 nanomètres toutes les cinq minutes pendant trente minutes à 37 degrés Celsius.
Dans ce protocole, l’intestin proximal et distal ont été isolés des foetus de souris E18 à E20. Lors de l’isolement, les cellules épithéliales ont été ensemencées dans des dômes de gel de matrice extracellulaire. Après environ 28 à 30 jours de culture, des organoïdes foetaux ont été développés à l’état adulte mûr.
Les marqueurs proximaux Onecut2 et Gata4 ont été principalement exprimés dans la culture organoïde proximale, tandis que les marqueurs distal Fabp6 et Guca2a ont été principalement exprimés dans la culture organoïde distale. Les marqueurs foetaux lactase, Ass1, Blimp-1 et récepteur néonatal de Fc ont diminué dans leur expression relative et les marqueurs adultes sucrase isomaltase, argenase 2, trehalase et lysozyme ont augmenté au fil du temps dans les cultures organoïdes proximales et distales. Les effets des facteurs extrinsèques ne devraient pas nécessairement être génomiques.
L’expression génétique du marqueur foetal Blimp-1 a été diminuée au jour 12 pour les organoïdes dexaméthasone-traités comparés aux organoïdes de contrôle. Cependant, l’expression de gène et l’activité enzymatique des marqueurs adultes sucrase isomaltase ont été augmentées. Lors de l’utilisation de ce protocole, il est important de se rendre compte que seuls les organoïdes du stade fœtal tardif sont capables de transiter vers des organoïdes adultes in vitro.
Le nombre de six à dix fœtus comme point de départ de cette culture peut être encore réduit en utilisant l’intestin entier pour étudier la maturation globale. La valeur translationnelle de ce modèle réside dans la possibilité que les effecteurs des extrêmes de groupe élevé soient capables de moduler la maturation intestinale qui est un processus conservé entre les mammifères allaitants.
