Les avantages les plus importants de cette technique sont la réversibilité, la réduction du coût des animaux et de l’entretien, et une période de grossesse plus courte. De plus, la mortalité animale est réduite parce qu’il n’est pas nécessaire de faire de l’hystérectomie. Et il y a des possibilités plus larges de travail génétique.
Cette technique peut être employée pour étudier la pathophysiologie de l’hernie diaphragmatique congénitale. Il peut également être appliqué à la compréhension d’autres maladies dans le poumon, telles que les vaches et l’hypoplasie pulmonaire. Commencez par permettre aux souris de s’accoupler dans la même cage de 18 h à 9 h le lendemain.
Pour déterminer e0, observez le bouchon vaginal qui a une zone homogène et extérieure attachée à la paroi vaginale et une zone intérieure qui est fibreuse et inclure quelques spermatozoa qui forment des masses emmêlés mélangés avec les fibres du matériel de prise. Enregistrez le poids des souris au moment de l’accouplement et sur E10 pour assurer une grossesse continue et effectuer la chirurgie à E16.5. Stériliser les instruments qui vont être utilisés pendant la chirurgie.
Préchauffer la plate-forme chirurgicale à 24 degrés Celsius et préparer la solution saline chaude avant la chirurgie. Créez un environnement chaud pour la récupération et laissez les aliments humides à l’intérieur de la cage pour l’alimentation précoce. Nettoyez la surface abdominale avec de l’alcool et de l’iode de povidone et maintenez des conditions stériles tout au long de l’opération.
Effectuer une incision verticale pour la laparotomie des mères enceintes et couper toutes les couches séparément. Identifiez les cornes utérine de chaque côté et déterminez les foetus candidats pour la chirurgie. Opérer sur deux fœtus dans chaque corne utérine s’il ya un nombre même de fœtus de chaque côté.
Et sur un foetus dans chaque corne utérine s’il y a un nombre impair. À l’aide de lunettes de grossissement 2X pour la visualisation, placez la corne utérine d’une manière transversale. Placez les chiots orientés vers le haut entre deux doigts en utilisant les yeux et la queue comme guide.
Appliquez une pression douce sur la tête du chiot pour permettre l’extension de la tête et la visualisation du cou. Effectuer l’occlusion trachéale ou TO à l’aide d’une aiguille atraumatique et d’une suture de polypropylène 6 x 0. Gardez le placenta sur le côté et loin des points d’entrée et de sortie de l’aiguille.
Insérez l’aiguille transversalement par le côté de l’utérus, loin du placenta par la partie antérieure d’un tiers du cou. Déplacez ensuite doucement l’aiguille vers le milieu du cou. Dirigez-le vers la partie antérieure.
Puis sortir du cou entre la trachée et en face de la gaine carotide et l’utérus. Nouer la suture, en prenant soin de maintenir l’intégrité des membranes et de la paroi utérine. Remplacer la corne utérine dans l’abdomen et injecter deux millilitres de solution saline stérile chaude dans la cavité péritonéale avant la fermeture.
Placez une suture de polyglactine de 5 par 0 pour fermer la paroi abdominale. Et fermez la peau avec une suture de soie non courante. Appliquer 0,1 microgramme par kilogramme de buprénorphine intrapénitéralement pour l’analgésie et permettre au barrage de récupérer dans un incubateur chaud.
Observez que l’animal opéré peut se nourrir et le garder seul dans sa cage individuelle. Récoltez tous les fœtus par E18.5 par césarienne et vérifiez leur viabilité en observant leurs mouvements. Pesez tous les fœtus.
Effectuer une incision verticale sur le thorax pour une thoracotomie pour disséquer les poumons. Et pesez-les pour calculer le rapport poids total poumon/corps. Casser le gel des tissus dans l’azote liquide, composé de température de coupe optimale, et la glace sèche.
Couper les échantillons en sections de 10 micromètres à l’aide d’un cryostat et les monter sur des glissières recouvertes de polylysine. Cuire les toboggans toute la nuit à 60 degrés Celsius et tacher les toboggans cuits au four avec de l’hématoxyline et de l’éosine. Image des glissières au grossissement de 10 à 20X, à l’aide d’un microscope à champ large.
Pour les analyses de protéines et d’ADN, casser geler le tissu et l’homogénéiser dans 300 microlitres de tampon d’analyse radioimmunoprecipitation. Centrifugeuse à 18 000 x g et 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis extraire et quantifier les protéines, l’ADN et l’ARN.
Le poids corporel moyen, le poids de poumon, et LBWR étaient plus élevés dans le groupe de TO que dans le groupe témoin. Les quantités d’ADN pulmonaire et le rapport ADN/protéines étaient plus élevés dans le groupe TO. Aucune différence n’a été observée dans l’ARN pulmonaire, et les quantités de protéines étaient plus faibles dans le groupe TO que dans le groupe témoin.
Les analyses histologiques des poumons de contrôle E18.5 ont montré le stade sacculaire tardif ou précoce du développement pulmonaire avec le développement de l’espace aérien et l’épaississement de l’interstitium entre les surfaces épithéliales. Les poumons du groupe TO avaient dilaté les espaces aériens centraux et distals avec un nombre subjectivement plus élevé de noyaux. Lorsque nous tentons ce protocole, nous fixons les sutures d’une manière que les yeux du fœtus sont visibles et le cou est étendu de sorte que l’aiguille ne perturbe pas les structures ajustées.
L’enlèvement des structures à la renaissance du fœtus dans le ventilateur nitrile et les modèles knockout de CDH seront les applications futures de cette technique.
