Este protocolo describe un cultivo de células intestinales fetales de ratón que es el más adecuado para lograr la maduración a la etapa adulta in vitro. Este enfoque in vitro se puede utilizar para estudiar los mecanismos moleculares de la transición de la lección al destete, así como los moduladores de este proceso y para lograr un uso más eficiente de los animales experimentales. Es esencial que este modelo in vitro de maduración intestinal utilice células intestinales primarias desde la etapa de desarrollo tardía, entre los días embrionarios 18 y 20.
Con dos pequeños fórceps, estira el intestino. Usando el estómago y el apéndice como guías, corte las partes proximal y distal del intestino delgado. Usando el apéndice como guía, corte los dos puntos.
Para hacer que el intestino se abra longitudinalmente, coloque una cuchilla de afeitar a lo largo del intestino y tire del intestino deslizando fórceps a lo largo de la cuchilla de afeitar. Posteriormente, cortar el intestino abierto en trozos de un centímetro. Prepare tres tubos de 50 mililitros con diez mililitros de PBS helado.
Transfiera las partes proximal y distal del intestino delgado y el colon por separado a los tubos. Mantenga los tubos sobre hielo mientras disecciona los intestinos de ratones adicionales. Recoger todas las partes intestinales de una camada juntas en el mismo tubo.
Después de lavar las piezas intestinales con PBS helado, incubar con dos EDTA mililolares durante 30 minutos. Para disociar las criptas del tejido, lave parcialmente las piezas con PBS frío y el suero de ternero diez por ciento y filtre a través de un colador celular de 70 micras en un nuevo tubo. Repita el lavado del tejido dos veces más y combine la solución filtrada.
Centrifugar la solución filtrada que contiene las criptas a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recoger las criptas como un pellet. Transfiera las criptas a un tubo de 15 mililitros y centrifugar de nuevo. A los pozos de la placa, añadir la cantidad total de gel de matriz extracelular necesario en el tubo y disolver el pellet.
Añadir 20 microlitros de las criptas disueltas en cada pozo de una placa caliente de 48 pozos. Después de enchapar el primer pozo, mirar bajo el microscopio para confirmar la densidad de alrededor de 250 a 300 criptas por pozo. Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante diez minutos para dejar que el gel de matriz extracelular se solidifique.
A continuación, prepare el medio ENR. Añadir 250 microlitros del medio ENR en cada pozo en el gel. Cambiar el medio tres veces por semana y pasar los organoides una vez a la semana.
Durante un mes, cada tres días después de cada pasaje, analice la cultura. Tres días después de cada paso, aísle el ARN de un pozo añadiendo 200 microlitros de tampón de lisis de ARN complementados con dos microlitros de beta mercaptoetanol al pozo. A continuación, transfiera la muestra del pozo a un tubo de 1,5 mililitros libre de RNAse.
En nuestros experimentos in vitro, hemos utilizado dexamethosona como ejemplo de un factor externo que se sabe para acelerar la maduración intestinal in vivo. Para aislar la proteína, agregue 250 microlitros de solución de recuperación de células heladas por pozo a cinco pozos de organoides y recójalos todos en un tubo de 15 mililitros. Incubar durante al menos 30 minutos sobre hielo para disolver el gel de matriz extracelular.
Lavar con PBS frío helado, añadir 250 microlitros de tampón de lelisis celular, y almacenar a menos 80 grados Celsius. Para analizar la actividad enzimática, primero prepare 0.625 tampón maleico molar a pH seis y 0.05 soluciones molares de lactosa, sacarosa, maltosa y trehalasa y guárdelas en hielo. Preparar las normas de ensayo diluyendo 5,56 solución de glucosa molar con agua ultrapura para obtener soluciones con 5 concentraciones diferentes.
Luego, en una placa de 96 pozos, agregue ocho grupos diferentes de suaveto organoide con sus respectivos sustratos, incluyendo estándares y control según el manuscrito. Incubar durante 60 minutos a 37 grados centígrados. Para determinar la cantidad de glucosa producida por las enzimas presentes en el color organoide, agregue rápidamente 200 microlitros de solución de color PGO recién preparada y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a 450 nanómetros cada cinco minutos durante treinta minutos a 37 grados Centígrados.
En este protocolo, el intestino proximal y distal se aisló de fetos de ratón E18 a E20. Tras el aislamiento, las células epiteliales se sembraron en cúpulas de gel de matriz extracelular. Después de aproximadamente 28 a 30 días de cultivo, los organoides fetales se desarrollaron para el estado adulto maduro.
Los marcadores proximales Onecut2 y Gata4 se expresaron principalmente en el cultivo organoide proximal, mientras que los marcadores distales Fabp6 y Guca2a se expresaron principalmente en el cultivo organoide distal. Los marcadores fetales lactasa, Ass1, Blimp-1 y neonatal Fc receptor disminuyó en su expresión relativa y los marcadores adultos sucrase isomaltasa, argenase 2, trehalase y lisozima aumentaron con el tiempo en cultivos organoides distales proximales y distales. Los efectos de los factores extrínsecos no necesariamente deben ser genómicos.
La expresión génica del marcador fetal Blimp-1 disminuyó en el día 12 para los organoides tratados con dexametasona en comparación con los organoides de control. Sin embargo, tanto la expresión génica como la actividad enzimática de los marcadores adultos sucrasa isomaltasa aumentaron. Al utilizar este protocolo, es importante darse cuenta de que sólo los organoides de etapa fetal tardía son capaces de transitar a organoides adultos in vitro.
El número de seis a diez fetos como punto de partida de este cultivo se puede reducir aún más mediante el uso de todo el intestino para estudiar la maduración general. El valor traslacional de este modelo radica en la posibilidad de que los efectores extremos de alto grupo sean capaces de modular la maduración intestinal, que es un proceso conservado entre los mamíferos lactantes.
