Bu protokol, in vitro yetişkin aşamasına olgunlaşma elde etmek için en uygun fare fetal bağırsak hücrelerinin bir kültür açıklar. Bu in vitro yaklaşım emzirme-evlenmemiş geçiş moleküler mekanizmaları yanı sıra bu sürecin modülatörleri çalışma ve deneysel hayvanların daha verimli kullanımı elde etmek için kullanılabilir. Bu bağırsak olgunlaşma bu in vitro modeli için geç gelişim aşamasından birincil bağırsak hücreleri kullanmak için esastır, embriyonik gün arasında 18 ve 20.
İki küçük çalgılarla bağırsağı uzat. Kılavuz olarak mide ve apandis kullanarak, ince bağırsağın proksimal ve distal bölümlerini parçalara ayırın. Bir kılavuz olarak apandisi kullanarak, kolon ayrı kesti.
Bağırsak uzunlamasına açık hale getirmek için, uzunlamasına bağırsak boyunca bir jilet yerleştirin ve jilet boyunca forceps kaydırarak bağırsak çekin. Daha sonra, bir santimetre parçalar halinde açılan bağırsak kesti. Buz gibi pbs on mililitre ile üç 50 mililitrelik tüpler hazırlayın.
İnce bağırsağın proksimal ve distal kısımlarını ve kolonu tüplere ayrı ayrı aktarın. Ek farelerin bağırsaklarını parçalarken tüpleri buzüzerinde tutun. Aynı tüp içinde birlikte bir çöp tüm bağırsak parçaları toplamak.
Buz gibi PBS ile bağırsak parçaları yıkadıktan sonra, 30 dakika boyunca iki milimolar EDTA ile kuluçka. Dokudan crypts ayrıştırmak için, kısmen buz soğuk PBS ve yüzde on buzağı serum ile parçaları yıkayın ve yeni bir tüp içine 70 mikron hücreli süzgeç ile filtre. İki kez daha doku yıkama tekrarlayın ve filtrelenmiş çözelti yi birleştirin.
150 kez G'de bulunan filtrelenmiş çözeltiyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca bir pelet olarak toplamak için santrifüj edin. Mahzenleri tekrar 15 mililitrelik bir tüpve santrifüje aktarın. Plaka kuyuları için, tüp içine gerekli ekstrasellüler matris jel toplam miktarını ekleyin ve pelet çözünür.
Sıcak 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya çözünmüş mahzenlerden 20 mikrolitre ekleyin. İlk kuyuyu kaplamadan sonra, her kuyuda yaklaşık 250-300 mahzenin yoğunluğunu doğrulamak için mikroskop altına bakın. Ekstrasellüler matris jel katılaşmak için on dakika boyunca 37 derece santigrat santigrat inkübatör plaka yerleştirin.
Sonra, ENR orta hazırlayın. Jel üzerine her kuyuya ENR ortamının 250 mikrolitreekleyin. Haftada üç kez orta değiştirin ve haftada bir kez organoidler geçirin.
Bir ay boyunca, her pasajdan sonra her üç günde bir, kültürü analiz edin. Her pasajdan üç gün sonra, rna'yı bir kuyudan izole edin, kuyuya iki mikrolitre beta merkaptoetanol ile takviye edilmiş 200 mikrolitre RNA lysis tamponu ekleyin. Daha sonra, kuyudan bir RNaAse-free 1.5 mililitre tüp içine örnek aktarın.
In vitro deneylerimizde, deksametofon'u in vivo bağırsak olgunlaşmasını hızlandırdığı bilinen bir dış faktöre örnek olarak kullandık. Proteini izole etmek için, beş tane organoid kuyuya her kuyuda 250 mikrolitre buz gibi soğuk hücre kurtarma çözeltisi ekleyin ve hepsini 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücre dışı matris jeli eritmek için en az 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yat.
Buz gibi PBS ile yıkayın, hücre lisis tampon 250 mikrolitre ekleyin ve eksi 80 santigrat derece saklayın. Enzim aktivitesini analiz etmek için, önce pH altı ve 0.05 laktoz, sakkaroz ve trehalaz molar çözeltilerinde 0.625 molar maleik tampon hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. 5 farklı konsantrasyonda çözelti elde etmek için ultra saf su ile 5,56 molar glikoz çözeltisini seyrelterek ölçüm standartlarını hazırlayın.
Daha sonra, 96 kuyulu bir plakaiçine, makaleye göre standartlar ve kontrol de dahil olmak üzere kendi alt tabakaları ile organoid lysate sekiz farklı gruplar ekleyin. 37 derecede 60 dakika kuluçkaya yat. Organoid lysate mevcut enzimler tarafından üretilen glikoz miktarını belirlemek için, hızlı bir şekilde taze hazırlanmış PGO renk çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece otuz dakika boyunca her beş dakikada 450 nanometre spektrofotometre üzerinde absorbans ölçmek.
Bu protokolde proksimal ve distal bağırsak E18'den E20 fare fetuslarına izole edildi. İzolasyon üzerine epitel hücreleri hücre dışı matriks jel kubbelerinde tohumlandı. Yaklaşık 28-30 günlük kültürden sonra olgun erişkin duruma fetal organoidler geliştirilmiştir.
Proksimal belirteçler Onecut2 ve Gata4 daha çok proksimal organoid kültürde, distal belirteçler Fabp6 ve Guca2a ise daha çok distal organoid kültürde ifade edildi. Fetal belirteçler laktaz, Ass1, Blimp-1 ve neonatal Fc reseptörü göreceli ekspresyonlarında azalmış ve erişkin belirteçleri sucrase izomaltaz, argenaz 2, trehalase ve lizozim hem proksimal hem de distal organoid kültürlerde zaman içinde artmıştır. Dışsal faktörlerin etkileri mutlaka genomik olması gerekmez.
Dedektazon lu organoidler için fetal marker Blimp-1'in gen ekspresyonu 12. Ancak erişkin belirteçlerin hem gen ekspresyonu hem de enzim aktivitesi artmış. Bu protokolü kullanırken, sadece geç fetal evre organoidlerin in vitro erişkin organoidlere geçiş yeteneğine sahip olduğunu fark etmek önemlidir.
Bu kültürün bir başlangıç noktası olarak altı ila on fetussayısı daha genel olgunlaşma çalışma için tüm bağırsak kullanılarak azaltılabilir. Bu modelin çeviri değeri yüksek grup aşırı efektörleri emzirme memeliler arasında korunan bir süreçtir bağırsak olgunlaşma modüle yeteneğine sahip olasılığı yatıyor.
