Ce protocole est significatif parce qu’il décrit un modèle pour l’infection chronique de blessure d’aeruginosa de Pseudomonas sans avoir besoin de l’implantation étrangère de matériel ou de la suppression immunisée. Inoculation retardée avec Pseudomonas aeruginosa 24 heures après l’épaisseur complète excisional blessure prosterne le dégagement rapide et la diffusion de la bactérie, établissant une infection qui dure sept à dix jours. Ce modèle unique sera un outil utile pour les études de la pathogénie bactérienne, les interactions avec les pathogènes hôtes, et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques des plaies pseudomonas aeruginosa.
M’aider dans une démonstration de l’intervention sera Dan Liu, un étudiant en médecine du Laboratoire Bollyky. Avant de commencer la procédure, pesez une souris anesthésiée de huit à 12 semaines pour obtenir un poids de base et placer la souris dans la position couchée. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, injectez subcutanément à la souris 250 microlitres de chlorure stérile préchauffé de 0,9 % de sodium sur chaque flanc.
Utilisez un rasoir électrique pour enlever les cheveux de la zone dorsale de la souris et appliquer une fine couche de crème depilatory sur la peau exposée. Après 20 à 60 secondes, retirer les cheveux et l’excès de lotion avec de la gaze humidifié dans de l’eau chaude. Pour la chirurgie excisionnelle de blessure de pleine épaisseur, utilisez d’abord une aiguille de calibre 25 pour injecter sous-cutanéement 0,6 à un milligramme par kilogramme de buprénorphine à libération soutenue à la zone mi-dorsale de la souris et essuyer le site chirurgical d’une manière circulaire avec trois bêtadine stériles alternatifs et des écouvillons d’alcool.
Placez un drap d’enveloppement en plastique sur le site chirurgical et étirez la peau tendue caudally. Lorsque la peau a séché, utilisez un poinçon stérile de six millimètres de diamètre biopsie de la peau pour faire une incision initiale à travers l’épiderme dorsale gauche, suivie d’une deuxième incision sur l’épiderme dorsale droite. Utilisez des forceps pour tenter la peau à partir du centre de la zone de plaies tracées à gauche et utilisez des ciseaux pour exciser les couches épidermiques et cutanées.
Après avoir répété l’incision sur la zone de blessure décrite à droite pour créer des blessures excisionnelles symétriques, laver les deux blessures avec 50 microlitres de solution saline stérile. Lorsque le site chirurgical et la peau environnante ont séché, couvrir les plaies et le dorsum avec un pansement transparent film et placer la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la récumbence complète. 24 heures après la chirurgie, peser à nouveau la souris réanthésiée et injecter l’animal sous-cutanée avec 250 microlitres de chlorure stérile préchauffé de 0,9 % de sodium dans les deux flancs.
Ensuite, chargez 100 microlitres de la suspension de souche luminescente P.aeruginosa dans une seringue de bouchon de sécurité tuberculine de 500 microlitres équipée d’une aiguille de calibre 27 et injectez 40 microlitres de suspension bactérienne à travers le film transparent qui s’habille dans chaque plaie. Assurez-vous que la suspension bactérienne est bien mélangée et que la vinaigrette transparente est intacte. Assurez-vous de perforer la vinaigrette transparente une seule fois avec la lunette d’aiguille vers le haut.
Puis retourner la souris dans sa cage sur une page de chauffage avec surveillance et de fournir une pâte de supplément nutritionnel riche en calories pris en sandwich entre les granulés alimentaires sur le sol de la cage. Plaquez le reste de l’inoculum sur une plaque d’agar LB et comptez les colonies pour confirmer le nombre de bactéries qui ont été administrées. Pour l’imagerie in vivo des plaies infectées, suivez les protocoles de confinement de niveau de biosécurité deux pour le transport des souris vers et depuis l’instrument d’imagerie et placez la souris anesthésiée dans la position couchée dans la chambre d’imagerie.
Dans le logiciel d’imagerie, définissez le temps d’exposition, le binning, le f-stop et le champ de vision au besoin pour l’expérience. Ensuite, créez une région d’intérêt sur le site de la plaie et mesurez le flux moyen détecté en photons par seconde. Pour mesurer l’arrière-plan, créez une région d’intérêt sur une zone aléatoire sur la plate-forme d’imagerie et soustrayez le nombre de photons par seconde.
À la fin de l’expérience, dans une armoire de biosécurité, utilisez des ciseaux stériles et des forceps pour exciser les lits enroulés et placer chaque lit dans un millilitre de PBS stérile dans un tube de polypropylène de 1,5 millilitre. Hacher le tissu enroulé avec des ciseaux et incuber les morceaux de tissu sur un shaker à quatre degrés Celsius en 300 rotations par minute pendant deux heures. À la fin de l’incubation, vortex chaque tube pendant 10 secondes avant de diluer en série les effluents bactériens dans PBS et de placage des effluents bactériens dilués sur l’agar LB pour quantifier la charge bactérienne.
Cette image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que ce modèle entraîne une luminescence détectable. Dans cette expérience, l’infection a culminé au jour trois post-inoculation et a persisté sept jours après l’inoculation basée à la fois sur la bioluminescence et le nombre de colonies. La culture des bactéries isolées de la plaie démontre en outre que la colonie quantifiée formant des unités par plaie est corrélée avec la luminescence détectée.
Bien qu’il y ait une perte de poids rapide initiale immédiatement après l’injection, les injections salines et la nutrition supplémentaire peuvent restaurer les souris à leur poids initial. La dose calculée d’inoculation dont 50 % des plaies seront gravement infectées a été déterminée à environ 7,7 fois 10 à la deuxième colonie formant des unités par millilitre. Des doses plus élevées qu’une fois de 10 à la quatrième colonie formant des unités par millilitre entraînent un taux d’infection de 100 %.
Divers traitements topiques et systémiques peuvent être appliqués après les procédures de blessure et d’inoculation pour étudier de nouvelles thérapies potentielles pour Pseudomonas aeruginosa. Tous les travaux avec Pseudomonas aeruginosa et les souris infectées devraient être menés avec des précautions de sécurité BSL-2 conformément aux directives du comité institutionnel de biosécurité et d’utilisation des animaux du chercheur.
