Recherche dans le laboratoire de Bragonzi a été financé par la Fondation italienne de la fibrose kystique (CFaCore) et de l&#39;UE-F7-2009-223670. Une partie de ce travail a été réalisé dans ALEMBIC, un laboratoire de microscopie de pointe, et l&#39;histopathologie de la souris a été réalisée dans l&#39;Unité d&#39;anatomie pathologique (San Raffaele Scientific Institute).

Une. Préparer les bactéries Infection chronique (trois et deux jours avant souris Challenge) <ol><li> Sélectionnez le P. approprié aeruginosa souche à tester. </li><li> Inoculer une anse de P. aeruginosa d&#39;un -80 ° C culture mère à une plaque Trypticase Soy Agar (TSA) et incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Choisissez une seule colonie et inoculer dans 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) dans un tube de 15 ml enfichable plafonné et incuber à 37 ° C pendant une nuit dans un incubateur à agitation à 200 rpm. </li></ol> 2. Intégrer les bactéries dans les perles Agar pour l&#39;infection chronique (un jour avant l&#39;infection) <ol><li> Prendre une petite aliquote de culture d&#39;une nuit de bactéries, dilué à 1:50 dans du tampon phosphate salin (PBS) et mesurer la densité optique (DO) à 600 nm. </li><li> Diluer la culture bactérienne nuit en ajoutant 2 OD dans un nouveau tube de pression coiffé contenant 20 ml de TSB frais. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant environ 3 -4 h à identifier la phase dans un incubateur à agitation à 200 rpm, jusqu&#39;à un total de 10-15 OD est atteint. </li><li> Entre-temps, préparer la TSA, TSB faite avec de 1,5% d&#39;agar, dans un autoclave et équilibrer à 50 ° C dans un bain d&#39;eau. Equilibrer 150 ml de preautoclaved huile minérale lourde dans un erlenmeyer à 50 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Une fois P. aeruginosa atteint la phase de journal, de recueillir les cellules bactériennes par centrifugation à 2700 g pendant 15 min à 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot bactérien dans 1 ml de PBS stérile et à fond vortex pour remettre en suspension le culot totalement. </li><li> Mélanger 1 ml de suspension bactérienne avec 9 ml de TSA liquide pré-équilibré à 50 ° C. </li><li> Ajouter les 10 ml TSA-P. aeruginosa mélange à l&#39;huile minérale lourde (préchauffé à 50 ° C) et immédiatement en remuant pendant 6 min à température ambiante. L&#39;agitation doit produire un vortex visible dans l&#39;huile. </li><li> Refroidir le mélange à 4 ° C, sous agitation au minimum spEED pendant 35 min (Figure 1). </li><li> Placez le mélange agar-perles d&#39;huile dans la glace pendant 20 minutes supplémentaires. </li><li> Transférer l&#39;agar-perles en tubes de 50 ml Falcon et centrifuger à 2700 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Enlever précision huile minérale et laver avec du PBS stérile six fois, comme décrit à l&#39;étape 2.11. Après trois lavages, les billes peuvent être rassemblées en un culot par gravité au lieu d&#39;utiliser la centrifugeuse. Après le dernier lavage, remettre en suspension les perles d&#39;agar-20 à 30 ml dans du PBS. </li><li> Prélever une partie aliquote des billes (environ 0,5 ml) et d&#39;homogénéiser de façon aseptique. </li><li> Prenez 100 pi de perles homogénéisés et diluer dans 900 pi de PBS stérile. Diluer en série 01:10 jusqu&#39;à 10 -6. </li><li> Plate dilution en série sur des plaques de TSA, y compris un échantillon non dilué jusqu&#39;à 10 -6 et incuber les plaques à 37 ° C. </li><li> Mesurer le diamètre de bourrelet à l&#39;aide d&#39;un microscope optique inversé dans plusieurs domaines. Le diamètre du cordon doit être comprise entre 100-200 um ( <strong&gt; Figure 1). </li><li> Stocker les perles nuit à 4 ° C. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la préparation de billes et de la souris infection agar. P. aeruginosa cellules sont remises en suspension dans 1 ml de PBS et on a ajouté à 9 ml de TSA liquide (50 ° C). Ce mélange est ajouté à 150 ml d&#39;huile minérale lourde, à 50 ° C dans un ballon et on agite à grande vitesse pendant 6 min à température ambiante. Lorsque le ballon est refroidi à 4 ° C avec une agitation lente pendant 35 min, la gélose se solidifie créer des perles, et les bactéries présentes dans le mélange sont incorporés dans les perles d&#39;agar-agar. Détail d&#39;un bourrelet de gélose contenant des cellules bactériennes est signalée (A). Après avoir retiré l&#39;huile minérale avec plusieurs lavages à l&#39;aide de PBS stérile, la suspension d&#39;agar-perles est prêt fou l&#39;inoculation dans les poumons de souris par une injection intra-trachéale (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . 3. Souris Défi avec l&#39;agar-perles Déclaration éthique: ce protocole et d&#39;expérimentation suivent les directives du comité de protection des animaux et de l&#39;éthique de l&#39;Institut scientifique San Raffaele. <ol><li> Comptez le nombre d&#39;unités formant colonie (UFC) sur les plaques de TSA pour déterminer le nombre de CFU / ml dans la suspension d&#39;agar-billes. Diluer l&#39;agar-perles avec du PBS stérile à 2-4 x 10 7 UFC / ml pour atteindre un inoculum optimale de 1-2 x 10 6 à 50 pi. </li><li> Anesthésier C57Bl/6NCr (20 à 22 g, âgées de 6-8 semaines) chez la souris mâle avec de la kétamine (50 mg / ml) et de xylazine (5 mg / ml) dans du NaCl à 0,9% sont administrés à un volume de 0,002 ml / g de poids corporel par injection intra-péritonéale. NOTE: L&#39;anesthésie est considérée ADEQluer lorsque l&#39;animal reste toujours tranquillement, est insensible aux stimuli externes, et a coeur et taux respiratoires. </li><li> Placez la souris en position couchée. Désinfecter le manteau de la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Exposer la trachée par une coupe verticale de la peau et intuber la trachée avec un stérile, souple 22 G 0,9 mm x 25 mm cathéter IV, maintenir l&#39;attention de retirer le stylet tout en se déplaçant vers le bas dans la trachée. Insérer le cathéter n&#39;est pas trop profondément dans la trachée. S&#39;arrêter avant de la carène (bifurcation). </li><li> Prendre immédiatement un volume de 50 ul de la suspension de billes d&#39;agar par une seringue de 1 ml et l&#39;attacher au cathéter. Poussez doucement le piston de la seringue, permettant aux perles à implanter dans le poumon. Fermer l&#39;incision en utilisant des agrafes. </li><li> Placez l&#39;animal sur un coussin chauffant jusqu&#39;à ce que complètement réveillé. </li></ol> 4. Évaluation de souris <ol><li> Respecter les souris quotidiennement les signes cliniques, y compris la qualité de la robe, de la posture,marche, et l&#39;état d&#39;hydratation. Surveiller le poids corporel par jour. Les souris qui perdent ≥ 20% du poids corporel doivent être euthanasiés. </li><li> Suivez le point 5 de la collecte de fluide lavage broncho-alvéolaire (LBA) et les points 6 ou 7 pour la collecte des poumons et de l&#39;analyse sur un total de CFU, l&#39;analyse histologique, la réponse inflammatoire en termes de nombre total et différencié cellule de la BAL, l&#39;analyse des cytokines, et la myéloperoxydase (MPO). </li></ol> 5. BAL Collecte et analyse des fluides <ol><li> Euthanasier les souris par inhalation de CO 2. </li><li> Placez la souris en position couchée. Désinfecter le manteau de la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Exposer la trachée et de la cage thoracique par une coupe verticale de la peau. Exposer les poumons en coupant le diaphragme. </li><li> Insérez un fil de suture dans la trachée en utilisant des pinces et intuber la trachée avec un stérile, souple 22 g 0,9 mm x 25 mm cathéter IV. Tirez les deux extrémités du fil de suture pour lier le catheter de la trachée et de nouer le fil autour de la trachée. </li><li> Prélever un volume de 1 ml de RPMI 1640 en utilisant une seringue de 1 ml et l&#39;attacher au cathéter. Poussez le piston de la seringue pour laver les poumons et récupérer immédiatement le liquide, le stocker dans un tube de 15 ml. NOTE: Si les cytokines doivent être analysés, ajouter des inhibiteurs de protéase à RPMI 1640. </li><li> Répéter cette étape trois fois avec un total de 3 ml de milieu RPMI. A partir de maintenant, stocker le liquide de LBA sur la glace. Passez à l&#39;étape 6 pour la collecte et l&#39;analyse des poumons. NOTE: S&#39;il vous plaît noter que pas tout le liquide seront récupérés (2,8 ml maximum). </li><li> Pour la quantification des bactéries présentes dans le fluide de BAL, prélever une petite aliquote (300 pi), en série, diluer 1:10 dans du PBS stérile, plaque sur des plaques de TSA et incuber à 37 ° C pendant une nuit. </li><li> Compter les cellules totales en utilisant un microscope optique inversé lumière diluant une partie aliquote du fluide BAL 1:02 avec une solution Tuerk dans une chambre de comptage de cellules Burker. </li><li> Centrifuger le remaining LBA à 330 g pendant 8 min à 4 ° C. Prendre le surnageant pour l&#39;analyse ELISA de cytokines, stocker à -80 ° C. Suivez les étapes 5.10 à 5.13 pour le nombre de cellules écart par cytospin. </li><li> Si la pastille est rouge, lyser les erythrocytes de remettre en suspension le culot dans 250 à 300 pi de tampon de lyse RBC dilués à 1:10 dans de l&#39;eau distillée ultra pure pendant 3 min. Neutraliser avec 2 ml de PBS et centrifuger à 330 g pendant 8 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans du milieu RPMI 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Utiliser un volume qui fournira 1 x 10 6 cellules / ml, sur la base du nombre total de cellules. </li><li> Placer des lames de microscope et des filtres dans des fentes appropriées dans la cytospin avec les filtres en carton faisant face au centre de la cytospin. Introduire à la pipette 150 ul de chaque échantillon dans les puits appropriés de la cytospin et centrifuger dans un cytocentrifugeuse à 300 g pendant 5 min. </li><li> Colorer les lames par Romanowsky coloration utilisant un kit commercial, selon le males instructions tion du fabricant et comme décrit précédemment 12. Suivez les étapes 5.14 à 5.17 pour MPO analyse de l&#39;activité. </li><li> Centrifuger le volume restant de BAL à 380 xg pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 250 pl de chlorure Hexadecyltrimethylammonium à 0,5% dans de l&#39;eau distillée ultra pure pour lyser les cellules. La suspension peut être congelé à -20 ° C pendant plusieurs jours avant de réaliser le dosage. </li><li> Centrifuger à 16 000 g pendant 30 min à 4 ° C et en utilisant le surnageant pour effectuer dosage MPO dans des plaques à 96 puits, ajouter l&#39;échantillon en double exemplaire dans chaque puits et, si nécessaire, également des dilutions appropriées de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter à chaque échantillon dans les puits un volume égal de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tétraméthylbenzidine (TMB) comme substrat pour la peroxydase. Laisser la réaction doit se faire dans l&#39;obscurité pendant au moins 5 minutes et jusqu&#39;à ce que il n&#39;y a plus développement de la couleur. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 2 MH 2 SO 4 and mesurer la DO à 450 nm. La valeur de DO sera directement proportionnelle à l&#39;activité de la peroxydase. </li></ol> 6. Mesure de la charge bactérienne dans les poumons et de cytokines analyse <ol><li> Immédiatement après le prélèvement de fluide BAL, poumons d&#39;accise de la souris, les rincer dans du PBS stérile, lobes distincts, les mettre dans un tube à fond rond avec 2 ml de PBS stérile et stocker sur la glace. NOTE: Si cytokines sont à analyser, ajouter des inhibiteurs de protease à du PBS pour les tubes. </li><li> Homogénéiser aseptique poumons, prendre une petite aliquote (300 pi) de l&#39;homogénat, série diluer 1:10 dans PBS, plaque sur des plaques de TSA et incuber à 37 ° C pendant la nuit. S&#39;il vous plaît noter que la charge bactérienne des voies aériennes totale sera la somme des CFU trouvés dans le fluide BAL et les poumons. </li><li> Centrifuger l&#39;homogénat à 16 000 xg restant pendant 30 min à 4 ° C. Prenez le surnageant pour ELISA analyse des cytokines, et conserver à -80 ° C. </li></ol> 7. L&#39;examen histologique &lt;ol&gt; <li> Effectuer une analyse histologique seulement sur les poumons dans lequel le liquide de LBA n&#39;a pas été recueillies, afin de préserver l&#39;aspect et les propriétés du poumon. </li><li> Euthanasier la souris par inhalation de CO 2. </li><li> Exposer la cage thoracique par une coupe verticale de la peau, les poumons exposer en coupant le diaphragme. </li><li> poumons d&#39;accise, les rincer dans du PBS, séparent les lobes, les mettre dans un tube contenant du formol 5-10 ml 10% neutre tamponné (4% de formaldéhyde) et conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Intégrer poumons en paraffine, en utilisant des procédures standard. </li><li> Couper 5 sections um d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un microtome. </li><li> diapositives de coloration à l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine et couvrent les lames avec une lamelle, selon les procédures standard. </li><li> Examiner les lames à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à fond clair et à acquérir des images en connectant le microscope à un appareil photo. </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis.">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li><li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens.">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li><li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li><li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia.">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li><li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres.">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model.">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li><li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection.">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM.">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li><li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+the+host+response+using+murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection.">Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection.</a> Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).</li><li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 .</li><li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment.">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, .</li><li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells,+their+cytokines+and+mediators.">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence..">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence..</a> AJRCCM. In press, (2009).</li><li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains.">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li><li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response.">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, .</li><li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa:+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection.">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les étapes essentielles de la P. aeruginosa-perles préparation et le défi de la souris sont présentés ci-dessous. La souche de P. aeruginosa utilisé pour les souris défi est critique. La mortalité, une infection chronique ou clairance peuvent différer sensiblement en fonction de la souche bactérienne utilisée pour le défi. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car e...

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par des mutations dans le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) de gène. Ce gène code pour un canal chlorure exprimé sur la membrane de la plupart des cellules épithéliales. Dilatation des bronches, quantité de mucus et parenchymateuse destruction causée principalement par des infections à Pseudomonas aeruginosa conduit progressivement à une maladie pulmonaire grave et de mortalité dans la plupart des patients atteints de mucoviscidose 1. Comprendre la pathogenèse de la CF et le développement de nouvelles thérapies reposent sur un modèle animal avec caractéristiques de FC. Plusieurs souris, génétiquement modifiées pour le gène CFTR ont été générés, mais limites dans la capacité de ces espèces de récapituler les maladies pulmonaires CF-comme et plusieurs autres anomalies des organes observés chez les patients CF ont été largement documentés 2. Développement de l&#39;infection est l&#39;un des défis majeurs dans le modèle animal FC. Les cl de la littératuresuggère que tôt une infection chronique durant plus d&#39;un mois peut être atteint que si les souris sont inoculés avec des bactéries incorporées dans un agent d&#39;immobilisation tels que l&#39;agar, agarose, ou algues alginate 3-5. Ces agents immobilisants fournissent les conditions microaérobie / anaérobies qui permettent aux bactéries de se développer sous la forme de microcolonies, de façon similaire à la croissance dans le mucus de patients atteints de mucoviscidose 6. Ce modèle de l&#39;infection chronique conduit à la persistance de la bactérie dans les poumons, causant une inflammation des voies respiratoires et des dommages 7. Toutefois, en fonction de la méthode utilisée, la souche bactérienne et la dose inoculée dans les poumons, le pourcentage de souris infectées chroniques et la charge bactérienne dans les poumons récupéré à différents points dans le temps peuvent varier considérablement. En particulier, le principal défi pour l&#39;infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l&#39;épreuve, indiquant thacellules bactériennes sont progressivement effacés t par l&#39;hôte. En sélectionnant le P. aeruginosa RP73 souche clinique d&#39;une collection de FC isole 8 nous avons obtenu avec succès une faible mortalité, des lésions plus sévères, et le pourcentage élevé d&#39;infection chronique avec une charge bactérienne stable jusqu&#39;à un mois chez la souris C57Bl/6NCrl. Ce document détaille la méthodologie pour intégrer P. aeruginosa dans les billes d&#39;agar-agar, nous avons des souris infectées par instillation intratrachéale, mesuré la charge bactérienne et des cytokines dans les poumons, recueillies LBA et effectué un examen histologique. Dans l&#39;ensemble, ce protocole aidera les chercheurs à répondre à des questions d&#39;une importance fondamentale sur la pathogenèse 8,9 et de tester de nouvelles thérapies contre P. aeruginosa infection chronique 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">211823</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Difco Agar, granulated</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">214510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Heavy mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">330760-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">S-(+)-Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">K1884</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">X1251</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">1 ml syringe 25 G 5/8&#39;&#39;&#160;0.5 x 16 mm</td>
			<td style="width:191px;">PIC</td>
			<td style="width:143px;">3071250300350</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Catheter 22GA 0.9 x 25 mm</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">381223</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">11152-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Scissors, Iris, 11 cm, straight</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:143px;">501758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture clips</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">12040-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture thread</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">18020-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:143px;">11836145001</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td>
			<td style="width:191px;">Biosigma</td>
			<td style="width:143px;">390497</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Tuerk solution</td>
			<td style="width:191px;">Fluka</td>
			<td style="width:143px;">93770</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:143px;">420301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">EZ cytofunnel</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78710021</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">J3800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Diff-Quik Romanowsky staining set</td>
			<td style="width:191px;">Medion Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">130832</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Hexadecyltrimethylammonium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">52366-10G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">96-well EIA/RIA plate</td>
			<td style="width:191px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">3590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;- tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8665-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">320501-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-01005Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Harris haematoxylin non Papanicolau</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M06004</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Eosin plus alcoholic solution</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M11007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Shaking incubator</td>
			<td style="width:191px;">Amerex Instruments</td>
			<td style="width:143px;">Steady Shake 757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Water bath</td>
			<td style="width:191px;">Grant</td>
			<td style="width:143px;">SUB14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Precision balance</td>
			<td style="width:191px;">KERN</td>
			<td style="width:143px;">440-47N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Low Cost Heating Pad</td>
			<td style="width:191px;">2biol</td>
			<td style="width:143px;">LCHP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:272px;">Homogenization probe</td>
			<td rowspan="2" style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;">2366931(great)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:143px;">2366925(small)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted optical microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axioplan2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Camera (microscope)</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axiocam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Rotary microtome</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM2255</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice

Un modèle de souris de l&#39;infection chronique des voies respiratoires est un atout majeur dans la fibrose kystique (FK) la recherche, mais il ya un certain nombre de préoccupations concernant le modèle lui-même. Les premières phases de l&#39;inflammation et de l&#39;infection ont été largement étudiés en utilisant le modèle d&#39;agar-perles souris Pseudomonas aeruginosa, tandis que peu de rapports ont mis l&#39;accent sur ​​l&#39;infection chronique à long terme in vivo. Le principal défi pour l&#39;infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l&#39;épreuve, ce qui indique que les cellules bactériennes sont progressivement effacés par l&#39;hôte. Cet article présente une méthode pour obtenir une infection chronique efficace à long terme chez la souris. Cette méthode est basée sur l&#39;incorporation de la P. souches cliniques aeruginosa dans l&#39;agar-perles in vitro, suivie par instillation intratrachéale chez les souris C57Bl/6NCrl. Infection pulmonaire bilatérale est associée à plusieurs mesurables lecture-out, y compris la perte de poids, la mortalité, l&#39;infection chronique, et la réponse inflammatoire. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car elle a entraîné une mortalité relativement bas, des lésions plus sévères, et l&#39;infection chronique plus élevé. P. aeruginosa colonisation peut persister dans le poumon pendant plus de trois mois. Pathologie pulmonaire murin ressemble à celle de patients atteints de mucoviscidose avec une maladie pulmonaire chronique avancée. Ce modèle murin imite plus étroitement le cours de la maladie chez l&#39;homme et peut être utilisé à la fois pour des études sur la pathogenèse et pour l&#39;évaluation de nouvelles thérapies.

Lorsque le protocole est fait correctement, le P. aeruginosa agar-perles mesurent entre 100-200 um et peuvent être observés avec un microscope optique inversé par aspiration un petit volume de la suspension d&#39;agar-perles sur une diapositive. Des cellules bactériennes individuelles peuvent être consultées dans les perles d&#39;agar-agar, comme représenté en détail sur la figure 1. Le choix de P. aeruginosa souche utilisée dans la préparation d...

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Nous décrivons la méthode agar-perles d&#39;établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

22.3K vues.  San Raffaele Scientific Institute.  Nous décrivons la méthode agar-perles d'établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris. 

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l&#39;homme

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Recherche

Immunologie et infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa et le biofilm Saccharomyces cerevisiae en cellules à flux

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Génération de mutants de suppression de gène dans le cadre dans Pseudomonas aeruginosa et essai pour l'atténuation de virulence dans un modèle simple de souris de l'infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Culture de la petite colonie Variante de Pseudomonas aeruginosa et Quantitation de son Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...