Cette méthode d’hybridation microarray est utile pour comparer un grand nombre d’échantillons d’un organisme avec un génome connu. Par rapport à une approche de séquençage à haut débit, la quantité de données générées par cette méthode est beaucoup plus facile à manipuler et plus loin, il peut être analysé d’une manière plus rentable. La Dre Christiane Seiler, scientifique postdoctorale travaillant au groupe de recherche de Rosis à l’IPK de Gatersleben, démontrera la procédure.
Avant d’effectuer l’hybridation microarray à l’aide du kit d’hybridation d’expression génétique, préparez l’agent bloquant 10X selon les spécifications du fabricant et aliquot l’agent bloquant résultant en 200 volumes de microlitres. Ensuite, stockez l’agent bloquant à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Le jour de l’hybridation du microarray, décongeler un aliquot de 200 microlitres de l’agent bloquant 10X sur la glace et préchauffer le four d’hybridation à 65 degrés Celsius et un bloc thermique à 60 degrés Celsius.
Préparer le mélange de fragmentation pour chaque échantillon tel que décrit par le fabricant et mélanger les échantillons doucement sur un vortex. Après vortex, faites tourner brièvement les échantillons dans une microcentrifugeuse avant d’incuber pendant exactement 30 minutes dans le bloc thermique de 60 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, refroidir immédiatement chaque tube sur la glace pendant une minute avant d’arrêter la fragmentation avec 25 microlitres de tampon d’hybridation d’expression génétique 2X, des révolutions élevées par minute par tube.
Mélangez avec des tuyaux doux, en prenant grand soin de ne pas introduire de bulles, et centrifugez les tubes dans la température ambiante ambiante. À la fin de la vrille, placez immédiatement tous les tubes sur la glace et chargez chaque échantillon dans la glissière de microrése le plus rapidement possible. Ensuite, distribuez lentement 44 microlitres de chaque mélange d’hybridation au centre de chaque puits de joint, en prenant soin d’éviter d’introduire des bulles, et ajoutez 44 microlitres de tampon d’hybridation dans tous les puits inutilisés.
Placez immédiatement la glissière de microarray dans la bonne orientation sur le dessus de la glissière du joint, en prenant soin de ne pas renverser de liquide, et fermez étroitement l’assemblage d’hybridation. Faites pivoter l’assemblage pour confirmer l’absence de bulles d’air stationnaires et placez l’assemblage de la chambre d’hybridation dans le rotateur du four d’hybridation. Réglez la vitesse de rotation à 10 révolutions par minute, puis commencez l’hybridation à 65 degrés Celsius pendant exactement 17 heures.
Pendant que les échantillons s’hybrident, préparez trois assemblages de vaisselle de lavage dans les tampons de lavage appropriés tels qu’ils sont décrits dans les tableaux. Après exactement 17 heures d’hybridation, démonter une chambre d’hybridation sur un banc de laboratoire tapissé de papier sans peluche et transférer un sandwich microarray dans un plat contenant un tampon de lavage avec le code à barres microrésais face vers le haut dans une position inclinée sans submerger toute la glissière dans le tampon. À l’aide de forceps, séparer les deux glissières de verre et laisser glisser doucement le joint dans le fond du plat tout en gardant une prise ferme sur la glissière de microrése.
Soulevez lentement la glissière de microrésexe latéralement pour un transfert immédiat dans le support de microrésexe dans le plat deux avec une exposition minimale à l’air. Lorsque les huit glissières ont été placées uniformément le long de la grille, fixez le support de la grille et transférez l’ensemble du plat deux configurations à l’agitateur magnétique. Remuer délicatement la configuration pendant exactement une minute.
Pendant que les échantillons sont agités, transférez le plat trois de l’incubateur de 37 degrés Celsius sur un deuxième agitateur magnétique. Ajouter ensuite délicatement le tampon de lavage de 37 degrés Celsius deux au plat trois sans former de bulles. À la fin de l’incubation en remuant, transférer doucement et lentement la grille à glissière dans le plat trois et retirer le support de la grille.
Après avoir remué pendant exactement une minute, retirez lentement et doucement la grille de diapositives du plat et utilisez du papier sans peluche pour sécher soigneusement les deux côtés de chaque glissière, en plaçant chaque glissière dans une boîte de diapositives au fur et à mesure qu’elle est séchée. Après avoir laissé sécher les glissières pendant 15 minutes, transférez chaque glissière de microréseau dans un support de diapositives avec le code à barres orienté vers le haut et chargez les supports de diapositives assemblés dans un carrousel à balayage et séquencez en fonction du numéro de code à barres. Ensuite, numérisez immédiatement les diapositives.
Dans ce chiffre, un résultat représentatif d’une course pour tester la qualité de l’extraction de l’ARN est montré. Dans les analyses typiques d’échantillons à faible teneur en amidon, comme les feuilles d’orge, d’autres bandes d’ARN ribosomal provenant de chloroplastes sont évidentes. Les échantillons à haute teneur en amidon, comme les graines d’orge, présentent 18 et 28S ARN ribosomal.
Notez qu’aucune valeur automatisée du numéro d’intégrité de l’ARN ne peut être calculée pour les tissus végétaux verts, tels que les échantillons de feuilles, en raison de l’ARN ribosomal chloroplaste. Dans cette analyse représentative, une préparation et une hybridation de l’ARN à une puce de microrése d’orge personnalisée ont été effectuées comme démontré. La grille montre un exemple de signaux dérivés de chaque coin de la puce, y compris l’arrière-plan et la pointe des points de lecture utilisés pour l’étalonnage.
L’histogramme indique la déviation des points détectables avec des intensités de signal respectives. Comme nous l’avons observé, une hybridation réussie donne une large courbe en forme de Gaussian avec seulement des valeurs aberrantes mineures. Il est indiqué ici le rapport de contrôle de la qualité pour les signaux détectés.
Les valeurs de la diapositive hybridée sont données dans la colonne deux et la plage de valeurs acceptables est indiquée dans la colonne quatre. Cette méthode peut être utilisée pour traiter n’importe quel organisme expérimental où des informations substantielles sur le génome sont disponibles. L’utilisation de cette technique dans notre laboratoire nous a permis de comparer et d’analyser les changements transcriptomiques du riz et de l’orge qui surviennent après l’induction du stress de croissance.
