Ce protocole est important parce qu’il est, à notre connaissance, le premier à décrire un nouveau métal à base de centrifugeuse pour la purification cinétique des polysomes à partir de nodules symbiotiques de soja. Le gros avantage de cette technique est qu’en combinaison avec RNA-Seq, permet l’étude de la relation et organisée dans un tissu complexe tel que le nodule symbiotique. Pour commencer, pesez environ 0,2 gramme de nodules intacts dans un plat de pesée et transférez-les dans un tube de deux millilitres prérefroidi.
Ajoutez ensuite 1,2 millilitre de tampon d’extraction de polysomes, laissez l’échantillon décongeler pendant deux minutes et homogénéisez avec un broyeur de tissus jusqu’à perturbation complète et homogénéisation des nodules. Ensuite, incuber les échantillons sur de la glace en agitant doucement pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités et centrifuger à 16 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour enduire les débris. Ensuite, récupérez le surnageant et répétez l’étape de la centrifugeuse.
Après avoir soigneusement récupéré l’extrait cytosolique clarifié, transférer une partie aliquote de 200 microlitres dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 millilitre pour une isolation totale. Ensuite, versez 4,5 millilitres de la couche de saccharose à 33,5% dans les tubes de centrifugation et ajoutez 4,5 millilitres de la couche de 12% avec précaution et lentement avec une micropipette P-1000. Ensuite, mettez les tubes sur de la glace jusqu’à l’ajout de l’extrait cytosolique clarifié.
Chargez un millilitre de l’extrait cytosolique clarifié sur le coussin de saccharose en pipetant soigneusement sur la paroi latérale du tube. Ensuite, transférer les tubes ultracentrifugeurs dans des godets prérefroidis et centrifuger à 217,874 G pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté l’extrait cytosolique restant et le coussin de saccharose, remettre en suspension la pastille polysomale avec 200 microlitres de tampon de remise en suspension prérefroidi.
Ensuite, incuber pendant 30 minutes sur de la glace, puis transférer la remise en suspension polysomale dans des tubes prérefroidis de 1,5 millilitre pour procéder à l’extraction de l’ARN. Après homogénéisation des échantillons avec 750 microlitres du réactif d’isolement d’ARN, incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chloroforme froid et agitez vigoureusement les tubes pendant 15 secondes.
Ensuite, incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Centrifuger à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour la séparation des phases, et transférer 500 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un tube propre sans perturber la phase organique rose. Ensuite, ajoutez 375 microlitres d’isopropanol froid et 0,5 microlitre de glycogène libre ARN.
Ensuite, mélangez bien en pipetant de haut en bas. Incuber le mélange pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et centrifuger à 12 000 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, jetez le surnageant et lavez le précipité d’ARN avec un millilitre d’éthanol froid à 75%.
Mélanger par vortex bref. Ensuite, centrifuger à 7 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et sécher à l’air la pastille d’ARN.
Ensuite, dissoudre la pastille dans 50 microlitres d’eau libre d’ARN et incuber à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Évaluer la concentration et l’intégrité de l’ARN avec une électrophorèse capillaire très sensible et/ou une électrophorèse sur un gel d’agarose libre à 2 % d’ARN. Après avoir estimé le volume de l’échantillon, ajoutez 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires, trois volumes d’éthanol froid et 0,5 microlitre d’ARN, glycogène libre.
Ensuite, mélangez-les soigneusement. L’électrophorèse capillaire a été réalisée pour plusieurs fractions d’échantillons d’ARN associés totaux et polysomiques, qui ont démontré des bandes d’ARN ribosomique nettes, sans aucune apparence maculée. Cependant, cela n’est pas reflété dans les valeurs RIN, car elles se situent entre 5,9 et 7,5, ce qui correspond à des échantillons non intacts.
Le bioanalyseur n’a pas réussi à identifier les pics 18S et 25S observés dans les électrophérogrammes, tant pour les échantillons d’ARN total que pour les échantillons d’ARN associés aux polysomes. Il n’y avait aucun signe visuel de dégradation de l’échantillon. Cependant, un échantillon a été analysé pour visualiser le résultat d’un échantillon presque entièrement dégradé, à des fins de comparaison.
Le plus important est de travailler dans des conditions de préservation des polysomes et de l’ARN pendant tout le protocole. Après le séquençage des fractions d’ARN total et par, les modèles standard pour l’expression génique analysée peuvent être utilisés pour identifier les gènes d’expression différentielle au niveau de la transcription et de la traduction.
