Ce protocole aidera à déterminer l’activité des protéines ATPase en mesurant le phosphate libre résultant de l’hydrolyse de l’ATP par les protéines. Le dosage du vert malachite est une procédure simple, sensible, rapide et peu coûteuse pour la détection du phosphate inorganique. Il convient à l’automatisation et au criblage à haut débit de composés par rapport à sa cible.
Cette technique jouera un rôle important dans la découverte rapide d’inhibiteurs contre la protéine Hsp90, qui est une cible anticancéreuse importante. Pour commencer, pipeter 40 microlitres de phosphate étalon d’un millimolaire dans 960 microlitres d’eau ultrapure pour obtenir une solution de phosphate de 40 micromolaires. Ajouter cette solution selon les instructions du fabricant pour former une dilution en série du phosphate de 0 à 40 micromolaires.
Ensuite, utilisez huit microlitres de levure Hsp90 pour une activité ATPase mesurable. Ajouter le réactif vert malachite à l’essai blanc et au témoin positif, et vérifier que la différence de densité optique entre l’essai blanc et le témoin positif après l’addition est d’au moins 0,5 et inférieure à 1. Pour préparer l’ATP, transférer un milligramme d’ATP dans un flacon contenant 453,39 microlitres d’eau ultrapure pour obtenir une solution mère de quatre millimolaires.
Préparez l’ATP frais, car il peut s’hydrolyser spontanément avec le temps. Ajouter quatre microlitres de solution mère d’ATP à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,2 millimolaire. Ajouter l’ATP comme dernier composant à la réaction à l’aide d’une pipette multicanal afin que toutes les réactions commencent simultanément.
Ensuite, préparez un stock de 10 millimolaires de geldanamycine en dissolvant un milligramme dans 178,37 microlitres de DMSO. À l’aide de la solution mère, préparer une solution de 4 millimolaires, 0,8 millimolaire, 0,16 millimolaire, 0,032 millimolaire, 0,0064 millimolaire et 0,00128 millimolaire dans du DMSO par dilution en série. Ajouter deux microlitres de ces solutions mères à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,1 millimolaire, 0,02 millimolaire, 0,04 millimolaire, 0,0008 millimolaire, 0,00016 millimolaire et 0,000032 millimolaire.
Ensuite, préparez les puits avec les puits contenant le témoin blanc et négatif. Les puits contenant de la geldanamycine servent de témoin positif. Préparez les plaques de 96 puits et préparez un puits séparé pour les composés qui montrent une absorbance à 620 nanomètres pour enregistrer l’absorbance à cette longueur d’onde.
Ne pas montrer un puits séparé pour la geldanamycine, car la geldanamycine ne montre pas d’absorbance à 620 nanomètres pour la concentration utilisée dans ce test. Installez des puits d’essai en ajoutant de l’eau ultrapure à chaque puits. Ensuite, ajoutez la quantité requise de tampon de dosage et une solution composée telle que la solution de geldanamycine.
Ajouter Hsp90 aux puits appropriés et agiter les plaques pendant deux minutes sur un agitateur à plaques à température ambiante. Ajouter quatre microlitres de solution d’ATP à l’aide d’une pipette multicanal. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et agiter pendant deux minutes sur un agitateur à plaques à température ambiante à 200 tr/min.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Arrêtez la réaction en ajoutant 20 microlitres de réactif vert malachite dans le même ordre que l’ATP à l’aide d’une pipette multicanal et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Enfin, mesurez l’absorbance de la plaque à 620 nanomètres dans un lecteur de plaques.
En plus de la plaque A, ajouter 90 microlitres de tampon de dosage dans chaque puits. En plus de la plaque B, ajouter 90 microlitres de tampon avec Hsp90 dans chaque puits. En plus de la plaque C, ajouter 90 microlitres d’ATP, et en plus de la plaque D ajouter 90 microlitres de réactif vert malachite dans chaque puits.
Utiliser un système de distribution multicanal automatisé pour transférer 40 microlitres de solution de chaque puits de la plaque d’addition A aux plaques principales un et deux, et de la plaque B à la plaque principale trois et quatre. Transférer 20 microlitres de la solution de chaque puits de la plaque composée aux plaques principales un, aux plaques principales deux, aux plaques principales trois et aux plaques principales quatre. Secouer les plaques pendant une minute dans un shaker à 200 tr/min.
Transférer 20 microlitres de la solution de chaque puits des plaques d’addition C aux plaques principales un, deux, trois et quatre. Secouer les plaques pendant une minute dans un shaker à 200 tr/min. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant trois heures, puis transférer 20 microlitres de réactif vert malachite de la plaque d’addition D aux puits des plaques principales un, deux, trois et quatre.
Après une incubation de 15 minutes à température ambiante, mesurez l’absorbance de la plaque à 620 nanomètres dans un lecteur de plaques. La structure du vert de malachite et les réactions du réactif vert de malachite A avec le phosphate libre et la réaction ultérieure avec le réactif B sont montrées ici. Un graphique standard pour la concentration standard de phosphate est représenté dans cette figure.
Ici, l’axe des x représente la concentration de phosphate libre ou de pi en micromolaire, et l’absorbance à 620 nanomètres est représentée sur l’axe des y. Les barres d’erreur représentent l’écart entre les deux numéros d’échantillon. Le pourcentage d’activité de l’ATPase est utilisé pour mesurer l’inhibition dose-dépendante de la protéine par la geldanamycine.
Il a été observé que la geldanamycine inhibait la protéine de manière dose-dépendante avec une valeur CI50 de 0,85 micromolaire. Ici, chaque point est une moyenne de deux déterminations. Le développement de la couleur dans la plaque principale après l’ajout de l’agent vert malachite est montré dans cette image.
La couleur rose dans le puits A11 est due à la couleur composée. De même, le développement des couleurs dans la planche principale deux est montré ici. La couleur rose dans le puits A11 est due à la nature colorée du composé.
Le développement de la couleur après l’ajout du réactif vert malachite dans la plaque principale trois et dans la plaque principale quatre est montré ici. L’ajout d’ATP et de réactif vert malachite à intervalle de temps à chaque puits est une chose importante à retenir lors de la tentative de cette procédure.
