Nous allons démontrer deux protocoles aujourd’hui qui démontrent comment étudier la fonction cellulaire NK. Il ya deux aspects clés de la fonction cellulaire NK qui est qu’il est capable d’éradiquer les cellules tumorales et il est capable de migrer vers l’environnement micro tumeur. Ces deux protocoles, nous allons démontrer la capacité des cellules NK à éradiquer les cellules tumorales et aussi il est capable de migrer vers l’environnement micro tumeur.
Ainsi, les deux protocoles que nous allons démontrer aujourd’hui sont simples, ne nécessitent pas l’utilisation de l’activité radio et peuvent être établis dans la plupart des laboratoires qui a la capacité de faire de la biologie moléculaire et des travaux de culture cellulaire. Suresh Bugide et Suresh Chava, qui sont deux associés postdoctorat dans mon laboratoire, démontreront ces deux protocoles aujourd’hui. Deux évaluent la cytotoxicité 2 médiatisée de cellules de NK utilisant LDH, développent d’abord une ligne humaine de cellules cancéreuses de foie à 70-80%confluency dans une boîte de Pétri de culture cellulaire de 100 millimètres à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone.
Le jour de l’expérience, laver la culture avec cinq millilitres de PBS avant de traiter les cellules avec un millilitre de 0,25% trypsine EDTA jusqu’à ce que les cellules se soient détachées du fond de la plaque. Lorsqu’une seule suspension cellulaire a été obtenue, ajouter 10 millilitres de milieu de culture cellulaire aux cellules et transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation. Lavez la pastille cellulaire avec cinq millilitres de PBS avant de re-suspendre les cellules à une fois 10 à la 5ème cellule par millilitre de concentration moyenne de culture fraîche.
Ensuite, les graines 100 microlitres des cellules cancéreuses du foie humain cible par puits en triplicate par condition de traitement dans une plaque de puits 96 et ajouter une fois 10 à la 5e cellule humaine NK dans 100 microlitres de milieu à chaque cellule cible bien. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. À la fin de l’incubation, pelleter les cellules par centrifugation et transférer 100 microlitres de supernatant de chaque puits dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de puits de 96.
Ajouter 50 microlitres de substrat LDH à chaque puits avec un mélange complet et incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, arrêtez la réaction avec 50 microlitres de solution d’arrêt et mesurez immédiatement l’absorption sur un lecteur de plaque à 490 et 680 nanomètres. Ensuite, utilisez la formule pour calculer le pourcentage de cytotoxicité des cellules NK.
Évaluer la cytotoxicité négociée par cellules NK à l’aide de calcéine AM après la croissance des cellules de cellules cancéreuses du foie humain à une confluence de 70-80%, comme démontré re-suspendre les cellules en trois millilitres de DMEM sans sérum et étiqueter les cellules avec 1,5 microlitres de 10 millimolaire calcéine AM solution pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et laver les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS par lavage. Suspendre à nouveau les cellules à une fois 10 à la 5ème cellule par millilitre de concentration moyenne de culture et ajouter 100 microlitres de cellules à chaque puits d’une plaque de puits de 96 en triplicate par condition de traitement.
Ensuite, à une fois 10 à la 5e cellule NK humaine dans 100 microlitres de culture moyenne à chaque puits de cellules cibles et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. Après la fin de l’incubation, capturer au moins 10 champs différents d’images des cellules positives de calcéine AM pour chaque répétition de chaque condition de traitement au microscope à fluorescence à un grossissement 10 fois. Calculez ensuite le pourcentage de cytotoxicité à l’aide de la formule.
Pour mesurer la migration des cellules NK en réponse aux stimuli chemotactic recueillir les cellules NK humaines à partir d’une culture confluente de 70-80% et de suspendre à nouveau les cellules à un 2,5 fois 10 à la 6e cellules par millilitre de concentration moyenne de culture cellulaire NK sans sérum. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de milieu sans sérum contenant l’attracteur de chimio cellulaire NK d’intérêt par puits et placez un insert de culture de 6,5 millimètres de diamètre avec cinq pores micromètres dans chaque puits de milieu. Ajouter ensuite 100 microlitres de cellules NK au compartiment supérieur de chaque insert et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures.
À la fin du transfert d’incubation, tout le volume de cellules migrées non adhérentes du fond de chaque puits vers des tubes FACS individuels de cinq millilitres et ajouter 50 microlitres d’un nombre prédéterminé de perles de comptage de cytométrie d’écoulement à chaque tube. Ensuite, à l’aide d’un cytomètre d’écoulement évaluer chaque échantillon de cellule selon les protocoles standard d’analyse cytométrique flux et de calculer le nombre absolu de cellules NK migrées en utilisant la formule. Le renversement d’ATF4 réduit de manière significative la cytotoxicité cellule-201ée de NK comparée aux cellules de NK exprimant l’ARN court non spécifique d’épingle à cheveux.
Après coloration avec la calcéine AM le nombre de cellules cancéreuses humaines viables de foie diminue après co-culture avec les cellules humaines de NK comparées aux cellules cancéreuses humaines de foie cultivés sans cellules de NK. Comme prévu, atf4 knockdown via l’ARN à épingle à cheveux courte réduit nk cellule- médiatisée tuer des cellules cancéreuses du foie humain comme en témoigne un plus grand nombre de cellules calcéine AM-positive dans ces cultures. En outre, une quantité significativement plus élevée de migration de cellules NK est observée en réponse au milieu contenant de la chimiokine par rapport aux cellules NK exposées au milieu de contrôle sans chimiokine.
Pour l’évaluation de la cytotoxicité des cellules NK, il est important de normaliser nos ratios d’effort et de cible et le temps d’incubation pour chaque lignée de cellules cancéreuses. Une fois que les normes sont identifiées et validées, les évaluations in vitro sont complétées par des expériences sur des souris in vivo afin d’évaluer davantage leur rôle dans l’éradication des cellules tumorales.
