Cette méthode permet de déterminer le métabolisme naturel des cellules tueuses. Un paramètre clé dans l’activation en mesurant la consommation d’oxygène et les changements de pH dans le milieu extracellulaire. L’avantage de l’analyseur de flux extracellulaire est qu’il est entièrement automatisé et capable de tester jusqu’à 92 échantillons en temps réel avec de faibles quantités de cellules.
Permettant ainsi des écrans à haut débit. Une méthode valide pour déterminer la glycolyse et la respiration dans les cellules inky est très importante dans la clinique. Puisqu’il y a beaucoup de maladies comprenant l’obésité et le cancer où le métabolisme de cellules inky est altéré.
Commencez par pipetting 20 millilitres de milieu de séparation de lymphocyte dans un tube conique de 50 millilitres. Tout en gardant le tube à 30 degrés d’angle, pipette doucement 20 millilitres de sang sur le milieu. Création d’une interface visible et bien définie entre les deux fluides.
Centrifuger les tubes pendant 25 minutes à 1000 fois G.Puis retirer soigneusement les tubes de la centrifugeuse et les placer dans une grille. Vérifiez la présence d’une couche visible de cellules à l’interface entre le LSM et le plasma. Aspirez doucement la couche cellulaire mononucléaire avec une pipette en plastique de 10 millilitres et placez-la dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.
Lavez les cellules mononucléaires deux fois avec 45 millilitres de PBS. Et centrifugez-les à 800 fois G pendant cinq minutes. Pour isoler les cellules tueuses naturelles ou les engaves, comptez les mers du PVM et résuspendez-les dans le tampon de séparation des Savoirs traditionnels à une fois 10 à la huitième cellule par millilitre.
Transférer ensuite 10 millilitres de suspension cellulaire dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ajouter 500 microlitres de mélange d’anticorps d’isolement cellulaire NK. Et 10 microlitres d’anti CD trois mélange positif d’anticorps d’isolement aux PBMCs.
Et les incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Vortex perles magnétiques et ajouter un millilitre aux PBMCs et anticorps. Ensuite, incuber le MIGS pendant 10 minutes à température ambiante en remuant occasionnellement.
Ajouter 35 millilitres de tampon d’isolation NK et placer le tube sur l’aimant pendant 15 minutes. Recueillir soigneusement le supernatant avec une pipette en plastique de 50 millilitres sans toucher les côtés ou le fond du tube. Comptez les cellules et centrifugez-les à 800 fois G pendant cinq minutes.
Pour stimuler les cellules NK avec l’allée soluble 15, résuspendez 750 000 cellules dans 100 microlitres d’IMDM contenant 10% de HS dans un puits d’une plaque de puits de 96. Diluer l’allée humaine 15 à un microgramme par millilitre dans l’IMDM et 10%HS. Et ajouter 100 microlitres de l’allée humaine diluée 15 aux cellules.
Réparez un échantillon de contrôle avec des cellules non simulées et placez les deux échantillons dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Stimulez les cellules pendant 48 heures, puis effectuez l’analyse du flux extracellulaire. La veille de l’expérience, allumez l’analyseur et laissez-le chauffer jusqu’à 37 degrés Celsius.
Ouvrez le paquet de cartouche de censure et séparez la cartouche de la plaque utilitaire. Ajouter ensuite 200 microlitres de la solution calibrée à chaque puits de la plaque utilitaire. Et remettre la cartouche centrale en s’assurant que les capteurs sont complètement submergés.
Pour des résultats optimaux, incuber la cartouche pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur sans dioxyde de carbone. Qui a bien humidifié. Pour préparer une lame enduite d’adhésif, pipette 25 microlitres de la solution adhésive cellulaire à chaque puits de la plaque.
Et incubé à température ambiante pendant 20 minutes. Retirez ensuite la solution et lavez la plaque deux fois avec 200 microlitres d’eau stérile par puits. Gardez la plaque ouverte pendant 15 minutes à l’intérieur du capot de culture cellulaire pour permettre aux puits de sécher.
Centrifugeuse les cellules NK précédemment isolées ajoutent 200 fois G pendant cinq minutes. Retirez ensuite les supernatants et lavez les cellules dans un milieu de test de stress mitochondrial réchauffé ou un milieu de test de stress à la glycolyse. Pelleter les cellules à nouveau et les résuspendre à la concentration cellulaire préférée dans le même milieu.
Déposer 180 microlitres de suspension cellulaire par puits dans la plaque d’essai. Utilisez les puits A, A 12 H 1 et H 12 comme puits de contrôle pour la correction de fond. L’ajout de 180 microlitres du milieu d’essai à ces puits incubent la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur sans dioxyde de carbone.
Centrifuger la plaque à 200 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, observez les cellules sous le microscope pour vérifier qu’elles forment une couche de mano au fond du puits. Incuber les cellules pendant encore 25 minutes.
Solutions de travail chaudes à 37 degrés Celsius. Et réajuster leur pH à 7,4 si nécessaire. Chargez les composés précédemment préparés pour un test de résistance mitochondrial ou pour un test de stress de glycolyse dans les planches A, B et C de la cartouche de censure hydratée Remettre la cartouche de censure chargée dans l’incubateur tout en mettant en place le programme.
Pour configurer le protocole d’analyse de flux extracellulaire, ouvrez le logiciel et utilisez les définitions du Groupe pour définir les conditions de prétraitement. Utilisez l’onglet carte plaque pour indiquer les groupes de puits qui ont des conditions similaires Indiquez également la correction de fond et les puits vides. Réglez ensuite le programme dans l’onglet protocoles.
Démarrez le programme et placez la cartouche du capteur et la plaque utilitaire sur le plateau. Après l’étape d’étalonnage, remplacer la plaque calibrée pour la plaque d’essai par les cellules attachées. Une fois l’exécuteur terminé, récupérez les données et analysez-les.
Afin d’évaluer la pureté et la viabilité des cellules NK. De petits Watts Alec provenant des mers du PVM et de la population isolée de cellules NK ont été tachés et analysés par cytométrie d’écoulement. La pureté de la population de cellules NK a été établie en restant double contre cd trois et CD 56 ou NKP 46.
Beaucoup de taux de consommation d’oxygène mitochondrial pour les cellules humaines de NK sont montrés ici. Comme prévu, j’ai des numéros de cellules affiché des valeurs OCR plus élevées. Les nombres cellulaires étaient également corrélés linéairement avec la quantité d’ADN ou de protéines dans le puits.
D’autre part, des nombres de cellules plus élevés n’étaient pas optimaux. Parce qu’à l’ajout de DNP, la concentration d’oxygène dans le puits a été totalement épuisée dans chaque cycle. Ce qui a empêché le calcul précis de l’OCR.
Dans les cellules humaines de NK, 100 DNP de micromolar se sont trouvés pour être la dose optimale. Une expérience typique de test de stress mitochondrial avec 750 000 cellules NK par puits est montrée ici. Dans ce test Oligomycine conduit à une diminution spectaculaire de la consommation d’oxygène.
Et une augmentation de l’ECAR. Ce qui représente un passage à la glycolyse et un effort pour maintenir les niveaux cellulaires d’ATP. L’activation des cellules de NK par l’allée 15 a causé une augmentation de la consommation mitochondrique d’oxygène et de l’acidification extracellulaire.
La respiration basale maximale et atp liée a augmenté mais pas la fuite de proton ou la respiration non mitochondrique. En outre, le taux d’OCR/ECA a diminué indiquant un décalage vers un métabolisme glycolytique après stimulation d’IL 15. Lors de l’exécution de ce protocole, il est très important d’obtenir une population cellulaire pure et saine afin de déterminer le nombre optimal de cellules et de titrer la concentration d’uncablers.
