Cette méthode peut répondre à la question clé sur le rôle du système immunitaire inné dans l’infection à Clostridium, comme si et comment les macrophages reconnaissent ou phagocytose cet agent pathogène. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle peut être appliquée à de nombreuses bactéries anaérobies différentes, que le temps d’infection peut être manipulé, et que l’administration orale représente l’infection humaine normale beaucoup plus proche. Après la culture, transférer un millilitre de la culture dans une cuvette spectrophotomètre, et mesurer l’OD600.
Transférer la quantité requise dans un tube frais de 1,5 millilitre afin d’atteindre un OD final de un à 1,2 millilitre de volume final. Laver une fois avec un millilitre de 1X PBS, et centrifugeuse à 5000 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Resuspendez en un millilitre de 1X PBS.
Ajouter trois microlitres de solution de travail du colorant fluorescent préparé dans la suspension bactérienne d’un millilitre. Incuber l’échantillon pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après cela, laver les Clostridioides difficile tachés une fois avec 1X PBS pour enlever le colorant résiduel, et resuspendre en un millilitre de 1X PBS pour atteindre un OD600 de 1,0.
Tout d’abord, placez une goutte d’eau de 0,8 % sur les larves de poisson zèbre dans une boîte de Pétri à couvrir. Ajustez doucement les larves à une position latérale. Placez la boîte de Pétri sur la glace pendant 30 à 60 secondes pour permettre à l’agarose à faible fonte de se solidifier.
Ajoutez 30% du milieu de Danieau contenant 0,02% à 0,04% tricaine pour couvrir l’agarose. Pour préparer la solution d’injection, ajouter un microlitre de 0,5% de rouge phénol dans la solution PBS en neuf microlitres de clostridioides difficile inoculum teintés. Chargez une aiguille de microinjection calibrée avec la solution d’injection à l’aide d’un microchargeur.
Montez l’aiguille chargée dans un micromanipulateur et placez-la sous un microscope stéréo. Réglez la pression d’injection entre 600 et 900 hectopascals. Réglez le temps d’injection à 0,1 à 0,3 seconde pour obtenir 0,5 à 1,0 nanolitres.
Placez l’aiguille dans le micromanipulateur à un angle d’environ 45 degrés, en pointant vers les larves incorporées. Placez la pointe de l’aiguille au-dessus du tractus gastro-intestinal, près du pore ovogène. Percer à travers l’agarose, puis le muscle avec la pointe de l’aiguille.
Puis insérez-le dans le lumen intestinal, et injectez 0,5 à 1,0 nanolitres de Clostridioides difficile. Utilisez un microscope à fluorescence pour surveiller les larves injectées et utilisez une pointe microchargeur flexible pour ramasser les larves correctement injectées pour l’imagerie confocale. Dans une plaque d’agarose de 1,5 % avec rainures, placez une goutte d’agarose à faible fondante de 0,8 % sur les larves de poisson zèbre pour les couvrir.
Ajustez doucement les larves avec des têtes orientées vers la verticale à des angles de 45 degrés dans la rainure et la queue contre la paroi de la rainure. Actionner doucement l’aiguille à travers l’agarose, puis dans la bouche des larves de poisson zèbre, à travers l’œsophage. Une fois que le bout de l’aiguille est à l’intérieur de l’ampoule intestinale antérieure, appuyez sur la pédale d’injection pour libérer 0,5 à un nanolitres de culture bactérienne.
Remplissez le lumen de l’intestin. Ne le laissez pas déborder de l’œsophage ou du cloaque. Retirer délicatement l’aiguille de la bouche du poisson zèbre.
Après le gavage, sauvez les larves infectées de poisson zèbre de l’agarose avec une pointe flexible de microchargeur en coupant d’abord l’agarose loin, puis en soulevant les larves. Transférer ces larves dans le milieu stérile de Danieau à 30 %, et rincer deux fois. Après anesthésier les larves de poisson zèbre, ajouter de 200 à 300 microlitres d’agarose à faible fonte de 1 % pour couvrir les larves anesthésiées.
Placez la région infectée des larves contre une glissade de verre aussi étroitement que possible. Laissez l’agarose se solidifier sur la glace pendant 30 à 60 secondes. Submergez l’agarose dans le milieu de Danieau à 30%, avec 0,02% à 0,04%.
Procédez à l’image des larves à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal. Après avoir euthanasié les larves infectées de poisson zèbre, insérez une aiguille dans le tronc dorsal des larves de poisson zèbre près de la tête pour immobiliser le poisson zèbre. Retirer la tête derrière les branchies à l’aide d’une lancette.
Insérez une deuxième aiguille au milieu du tronc dorsal. Insérez une troisième aiguille dans l’abdomen du poisson zèbre et retirez l’intestin de la cavité corporelle. Utilisez une aiguille de microinjection pour transférer de 10 à 15 intestins dans un tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de 1X PBS stérile.
Homogénéiser les intestins avec un pilon pour perturber le tissu et préparer des homogénéités. Assurez-vous que le pilon atteint le fond du tube pour perturber complètement tous les intestins. Dans les homogénéités, ajouter clostridioides difficile milieu d’élevage contenant de la D-cyclosérine et de la céfoxitine, avec ou sans taurocholate, et incuber dans une chambre anaérobie.
Dans cette étude, les neutrophiles et les macrophages atteignent les sites d’infection. L’exemple d’une phagocytisation macrophage activée de deux bactéries montre la compensation par phagocytose et la digestion des Clostridioides difficile étiquetés. Le microgavage pour livrer des Clostridioides difficile étiquetés fluorescence dans le lumen intestinal des lignes de journaliste de macrophage et de neutrophile à cinq jours après fertilisation imite le chemin normal de l’infection de Clostridioides difficile.
Cependant, les neutrophiles et les macrophages n’ont pas montré la migration évidente au tractus gastro-intestinal pendant jusqu’à 12 heures après microgavage. Entre-temps, la fluorescence des Clostridioides difficiles étiquetés a disparu après environ cinq heures après microgavage. Des échantillons intestinaux 24 heures après l’infection ont été disséqués et ont montré la croissance bactérienne.
Aucune bactérie n’a augmenté dans le groupe témoin. À des moments ultérieurs, les échantillons incubés n’ont augmenté que dans le milieu contenant du TCA, ce qui suggère que les Clostridioides difficiles totaux dans l’intestin avaient formé des spores. 16S rDNA PCR a identifié la bactérie cultivée comme Clostridioides difficile, qui produisent des amplicons PCR spécifiques de taille prévisible autour de 800 paires de base.
Les cultures bactériennes cultivées sur une plaque CHROMID sont apparues comme des colonies noires typiques, ce qui indique en outre que les bactéries des intestins du poisson zèbre étaient clostridioides difficiles. Travailler avec des bactéries anaérobies exige que les étapes aérobies soient courtes parce que cela influence la biologie des bactéries bien sûr. La cellule immunitaire innée dans le poisson zèbre peut être manipulée.
Par exemple, ils peuvent déchiffrer le mécanisme des réponses innées des cellules immunitaires à l’infection. Notre méthode a indiqué que le poisson zèbre peut être un outil pour étudier l’agent pathogène anaérobie de l’intestin humain. Pour travailler avec des agents pathogènes multirésistants, il faut prendre des mesures de sécurité appropriées.
