Nous sommes reconnaissants à Léonie de Boer et Bas Zaat (Academic Medical Centre) pour nous fournir le S. epidermidis souche O-47. Nous remercions Rico Bongaarts, Francis Smet et Angela Comas (Union Biometrica) de l&#39;aide et des conseils à la COPAS XL et l&#39;analyse de BioImager VAST. Nous remercions Davy de Witt, Ulrike Nehrdich, et Laura van Hulst, de gardiennage de poissons, et d&#39;autres collègues de l&#39;Université de Leiden aux discussions utiles. Cette recherche s&#39;inscrit dans le cadre du projet P5.03 IBIZA du programme de l&#39;Institut des matériaux biomédicaux, co-financé par le ministère néerlandais des Affaires économiques la recherche, et du Programme Mix (Smart NWOA_6QY9BM) du ministère néerlandais des Affaires économiques et du Le ministère néerlandais de l&#39;Education, de la Culture et de la Science. Un soutien supplémentaire a été obtenu à partir du projet de l&#39;UE ZF-Santé (FP7-HEALTH-2009-242048), et a été soutenue par RMJ bourse Marie Curie comme chercheur expérimenté dans l&#39;UE initiale de formation du réseau FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR a reçu un financement de l&#39;entreprise commune Initiative médicaments innovants vertu d&#39;un accord de subvention n ° 115337, les ressources qui sont composés de la contribution financière du Programme de l&#39;Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et les sociétés de l&#39;EFPIA en auteurs de contribution.The aimables reconnaître davantage le soutien financier du Fonds de l&#39;Université de Leiden (LUF) pour la robotique et de Cyttron, dans le programme des subventions Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, qui à son tour est soutenu financièrement par l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique pour les installations d&#39;imagerie. L&#39;acquisition du système COPAS a été partiellement financé par la Division de la Terre et sciences de la vie (ALW) avec l&#39;aide financière de l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO, 834.10.004).

1. Souches bactériennes et conditions de croissance <ol><li> Préparer S. epidermidis inoculum <ol><li> Prenez plusieurs colonies individuelles de S. epidermidis souche O-47, contenant un dérivé pWVW189 vecteur d&#39;expression mCherry (De Boer L. non publié) à partir d&#39;un milieu Luria Bertani (LB) gélose additionné de 10 ug / ml de chloramphenicol et de la culture pendant une nuit à 37 ° C dans 25 ml de milieu LB supplémenté avec 10 pg / ml de chloramphenicol à midlog étape. </li><li> Centrifugeuse de 1 ml de la culture à 12 000 g pendant 1 min et ensuite les laver 3 fois avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) à 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Mesurer la densité optique à 600 nm (DO 600), et de diluer la suspension bactérienne à une DO 600 de 0,3 à 2% (p / v) de polyvinylpyrrolidone 40 (PVP 40) dans du PBS. Remarque: une DO 600 de 0,3 correspond à 1,0 x 10 8 unités formant des colonies / ml (cfu / ml). </li></ol&gt; </li><li> Préparer M. marinum inoculum <ol><li> Prenez plusieurs colonies individuelles de M. marinum souche M ou E11 contenant le vecteur pSMT3-mCherry exprimant de manière stable mCherry 10 à partir d&#39;une plaque de gélose Middlebrook 7H10 à 10% (v / v) d&#39;enrichissement Middlebrook OADC additionné de 50 pg / ml d&#39;hygromycine et culture pendant une nuit à 28 ° C dans 10 ml d&#39; bouillon Middlebrook 7H9 avec 10% (v / v) Middlebrook ADC enrichissement supplémenté avec 50 pg / ml d&#39;hygromycine. </li><li> Centrifugeuse de 1 ml de la culture à 12 000 g pendant 1 min et ensuite le laver 3 fois avec 1 ml de PBS stérile avec 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Mesurer la DO 600, et de diluer la suspension bactérienne à une DO 600 de 0,3 à 2% (p / v) dans du PBS pvp 40. Remarque: une DO600 de 1 correspond à 1,0 x 10 8 ufc / ml. </li></ol></li></ol> 2. Préparer le poisson zèbre oeufs <ol><li> Placez un maximum de 70 hommes et 50 té femelle sauvagepe poisson zèbre séparément dans la grande cuve de reproduction. Remarque: Placez la femelle dans la partie inférieure de la cuve de grand élevage. </li><li> Retirez le séparateur le lendemain dans la matinée, pour laisser le poisson zèbre commencer la reproduction. </li><li> Collecter les oeufs au fond du récipient de grand élevage par l&#39;intermédiaire du collecteur d&#39;oeufs dans un tube de 50 ml remplie d&#39;eau de l&#39;œuf (60 ug / ml océan instant de sel de mer). </li></ol> 3. Aiguilles d&#39;injection <ol><li> Obtenir disponibles dans le commerce sur mesure aiguilles capillaires de verre avec un diamètre intérieur de 10 um. </li></ol> 4. Plan expérimental de l&#39;injection <ol><li> Faire bouillir 100 ml de 1% (p / v) d&#39;agarose dans l&#39;eau d&#39;œuf, et laisser refroidir jusqu&#39;à environ 40 ° C. Verser agarose dans la plaque de micro-injecteurs automatisé et placer le timbre 1024-bien dans l&#39;agarose. Remarque: La plaque est prêt à utiliser lorsque refroidi. </li><li> Sur la automatisé microinjecteur exploitation logiciel, cliquez sur &quot;Calibrer scène»,puis cliquez sur la grille de bien &#39;1024 &#39;et placer la plaque d&#39;agarose dans le micro-injecteur et calibrer la plaque en cliquant sur l&#39;écran à la position du centre du puits. </li><li> Aller au menu &#39;aiguille »et cliquez sur« support d&#39;aiguille d&#39;étalonnage. </li><li> Remplissez l&#39;aiguille d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;une pointe de microloader soit avec 10 pi pvp 40 contenant 100 ufc / nl S. epidermidis ou 30 cfu / nl M. marinum, ou l&#39;utilisation pvp 40 que l&#39;injection simulée. </li><li> Placez l&#39;aiguille dans le micro-injecteur automatique et calibrer la position x, y en abaissant ou en déplaçant l&#39;aiguille vers le haut et en cliquant sur l&#39;écran à la position de l&#39;aiguille. Ensuite, calibrer la position z de l&#39;aiguille en cliquant sur l&#39;écran à la position de la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Répartir les oeufs sur la grille d&#39;agarose en utilisant une pipette de transfert en plastique, et éliminer l&#39;eau en excès d&#39;oeuf. Placer la grille d&#39;agarose dans le micro-injecteur automatique. </li><li> Aller à la «Injection menu &#39;et ajuster la «pression d&#39;injection&quot; mise à 200 hPa, le «temps d&#39;injection» 0,2 sec et la «pression de la rémunération» 15 hPa, qui est en corrélation avec 1 nl, dans le menu des paramètres FemtoJet. </li><li> Cliquez sur «Injecter» pour injecter la totalité de la plaque. </li><li> Recueillir les œufs après l&#39;injection en les lavant dans une boîte de Pétri (92 x 16 mm), avec un maximum de 70 embryons par boîte de Pétri, et incuber à 28 ° C. </li></ol> 5. Analyse cytomètre en flux <ol><li> Préparer l&#39;écoulement des particules de grande cytomètre selon les instructions du fabricant et remplir la cuvette d&#39;échantillon et le récipient de liquide de gainage avec de l&#39;eau de l&#39;oeuf. </li><li> Au logiciel d&#39;exploitation, allez dans le menu «PMT» et utilisez les paramètres suivants: 650 V pour le canal &quot;rouge&quot; et 0 V pour le «vert» et canaux «jaunes». Ensuite, allez au menu «Seuils de et utilisez les paramètres suivants: &#39;Optical densité &#39;de signal de seuil: 975 mV (valeur COPAS XL: 50) et le «temps de vol» (TOF) minimum de 320 microsecondes (valeur COPAS XL: 800) afin de réduire l&#39;influence des débris. </li><li> Pour une analyse sans trier les embryons passez à l&#39;étape 5.4, pour l&#39;analyse et le tri des embryons dans une boîte de Pétri passez à l&#39;étape 5.5 ou pour l&#39;analyse et le tri des embryons dans une plaque de 96 puits passez à l&#39;étape 5.6. </li><li> Placer les embryons dans l&#39;échantillon tasse et cliquez sur «Start» pour démarrer l&#39;analyse. Lorsque tous les embryons sont analysés arrêter l&#39;analyse en cliquant sur «stop». Enregistrez les données en cliquant sur «magasin tous». Remarque: Toutes les données sont stockées au format TXT, LMD, DAT, fichiers CSV et BSRT. Suivre le protocole à l&#39;étape 5.7. </li><li> Placer les embryons dans l&#39;échantillon tasse et définir le maximum de 70 embryons par plaque à trier en entrant 70 dans le menu &#39;Trier&#39;. Placez une boîte de Pétri vide sous la trieuse et cliquez sur «Manuel Trier &#39;. Lorsque le di Petri<html> sh est rempli, enregistrer les données en cliquant sur «magasin tous». Remarque: Toutes les données sont stockées au format TXT, LMD, DAT, fichiers CSV et BSRT. Suivre le protocole à l&#39;étape 5.7. </li><li> Placer les embryons dans l&#39;échantillon tasse et définir le maximum de 1 embryon par bien d&#39;être triés en entrant 1 dans le menu &#39;Trier&#39;. Placez une plaque de 96 puits vide dans le support de plaque gauche et cliquez sur «Remplir la plaque&quot;. Lorsque la plaque de 96 puits est rempli, enregistrer les données en cliquant sur «magasin tous». Remarque: Toutes les données sont stockées au format TXT, LMD, DAT, fichiers CSV et BSRT. Suivre le protocole à l&#39;étape 5.7. </li><li> Obtenez le fichier TXT pour traiter les données brutes, utilisez les paramètres de filtrage de données suivantes: «Statut Sélectionnez &#39;: 40, et si vous utilisez le module de tri&#39; Etat de tri». 6 Ensuite, utilisez les numéros à partir du signal de fluorescence totale de la &#39;Red &#39;canal pour calculer la moyenne et l&#39;écart type de la moyenne. Tracer ces ensembles de données dans un bar ou dispersion graphiques. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. traitement de la toxicomanie <ol><li> Analyser et trier à 3 jours après l&#39;injection (dpi), M. marinum embryons infectés en deux groupes égaux en utilisant la grosse particule cytomètre de flux (étape 5.5). Traiter un groupe avec un composé d&#39;intérêt dans son solvant de support et l&#39;autre avec seul solvant support (contrôle). Appliquer des traitements similaires à moquer contrôle injecté à essai pour effets secondaires des antibiotiques. </li><li> Répéter à 4 et 5 dpi l&#39;analyse (étape 5.5) et de rafraîchir l&#39;eau d&#39;œuf ou de l&#39;eau d&#39;œuf contenant le composé. </li></ol> 7. Haute Resolution Imaging <ol><li> Anesthésier les embryons avec 0,02% (p / v) de tampon ester éthylique de l&#39;acide 3-aminobenzoïque (tricaïne) dans l&#39;eau d&#39;œuf 10 min avant l&#39;analyse. </li><li> Préparer le système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés et la Grande Sampler de particules selon les instructions du fabricant. </li><li> Sélectionnez les images de référence correspondant à l&#39;âge des embryons de la «Imaging - Objet211; Configuration de détection &#39;menu. </li><li> Sélectionnez la quantité de photos et d&#39;orientation à effectuer par le système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés de la &#39;imagerie - de stocker des images automatique&#39; menu. </li><li> Placez une plaque de 96 puits rempli d&#39;embryons (de l&#39;étape 5.6) dans le support de plaque gauche de la Grande particules Sampler, et cliquez sur «Exécuter plaque. </li><li> Quand un embryon est détecté et correctement positionnée; l&#39;image de la tête et la queue séparément avec le CLSM l&#39;aide d&#39;un objectif 10X plaine sèche et assembler les images après l&#39;utilisation de logiciels de traitement d&#39;image. </li></ol>

<ol>
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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS est propriétaire de Life Science Méthodes BV qui produit des instruments utilisés dans cet article.

La méthode à haut débit décrit dans le présent document fournit un pipeline efficace rapide et économique pour dépister nombre élevé d&#39;embryons et larves de poissons avec différents types d&#39;infections. Utilisation de la grande cuve de reproduction au lieu de réservoirs traditionnels simples ou familiales reproduction facilité le contrôle du processus de ponte et la production d&#39;un plus grand nombre d&#39;œufs synchrones. Avec une version améliorée du système de micro-injection automatique 7, il est possible d&#39;injecter jusqu&#39;à 2500 oeufs presque tous dans le même étage de la cellule à l&#39;intérieur de 1 h. Avec ces mises à jour et l&#39;amélioration de logiciel, il est possible d&#39;injecter plus d&#39;œufs qu&#39;auparavant qui peuvent être utilisés pour effectuer de grands écrans de la drogue à la prolifération bactérienne comme à lire. Cependant, cette méthode est encore limité au jaune injection, d&#39;autres voies d&#39;injection, décrits par exemple par Benard et al. (2012) 6, nous l&#39;espérons, être incorporés dans le système de micro-injection automatique dans un proche avenir. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bien que ces méthodes sont étalonnées pour le criblage de poisson zèbre, il serait utile pour les applications avec d&#39;autres espèces de poissons ainsi. Par exemple, la carpe commune a été indiqué d&#39;avoir des avantages pour les écrans de drogue. Comme le poisson-zèbre, ovules et embryons à un stade précoce de la carpe commune sont transparentes mais avec le principal avantage de la taille importante du frai de centaines de milliers d&#39;œufs et de la disponibilité des lignes pures qui offrent un fond génétique plus constante 16. L&#39;analyse de grandes quantités d&#39;embryons infectés se fait avec le grand flux de particules à haut débit cytomètre. Cet appareil peut trier les embryons analysés en plaques à puits multiples ou une boîte de Pétri qui le rend particulièrement adapté pour tester un grand nombre de composés. Si une résolution d&#39;image plus élevée est nécessaire, que la configuration est adaptée de manière à ce que l&#39;écoulement des particules de grande cytomètre technologie peut être utilisée pour le pré-criblage et d&#39;analyser ensuite les échantillons à travers un milieumettre à une résolution plus élevée. Cela peut être fait en utilisant la technologie de contrôle automatisé des vertébrés 17, 18. Ce dispositif peut recueillir automatiquement des embryons vivants ou fixes entre 2 et 7 jours après la fécondation d&#39;une plaque multi-puits ou conteneur de vrac, l&#39;image de 360 ​​° à travers un capillaire en utilisant CLSM ou microscopie stéréo et de disposer à nouveau dans deux conteneurs de vrac permettant le tri manuel des embryons sur la base sur les images microscopiques. Les améliorations futures permettront le tri de l&#39;embryon après l&#39;imagerie dans la plaque à plusieurs puits, rendant ainsi possible de filtrer automatiquement grand nombre d&#39;embryons individuels au fil du temps avec CLSM. En supposant que dans les applications futures du système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés peut également être connecté à l&#39;écoulement de particules à grande cytomètre technologie sans la nécessité de larves de distribution avant en plaques à puits multiples, va conduire à un tri plus avancé. Ce document décrit l&#39;un d&#39;établissementd optimisation d&#39;une installation à haut débit pour étudier S. epidermidis et M. marinum infection comme un modèle pour la découverte de médicaments. Elle montre que le résultat de ces bactéries injectées dans le jaune dépend du stade de développement des œufs au moment de l&#39;injection. Injection de M. marinum E11 à l&#39;étape 16 à 128 de la cellule ou de la souche M à 16-64 stade cellulaire conduit au même schéma que les infections injection dans la veine caudale de 2, 6. Cependant cette configuration n&#39;est pas limitée à la prolifération des bactéries pathogènes seulement. Il a été démontré auparavant qu&#39;il est possible d&#39;injecter de manière robotisée solutions contenant de l&#39;ADN, de l&#39;ARN ou morpholinos pour la transgenèse, sur-expression et le gène knock-down études, respectivement 13. En outre, il a été montré que cette configuration est également utile pour l&#39;étude de la prolifération de cellules cancéreuses et de migration. Par conséquent, cette canalisation présente un procédé polyvalent pour le criblages à haut débit d&#39;une variété de mécanismes de signal dans le contextede l&#39;immunité innée, appliqué aux maladies infectieuses et le développement du cancer. Ces écrans peuvent être combinés à d&#39;autres pour la découverte de médicaments, mais également à l&#39;analyse des effets toxiques possibles des médicaments applicables identifiées.

À ce jour, le poisson zèbre (Danio rerio) a été établie avec succès comme un modèle efficace pour étudier une variété de maladies infectieuses 1. L&#39;embryon de poisson zèbre offre unique dans les possibilités d&#39;imagerie in vivo en raison de leur transparence et le grand nombre de lignes de journaliste transgéniques exprimant des protéines fluorescentes existantes. Cette puissante combinaison permet de suivre différents types de cellules immunitaires dans le temps tout en interagissant avec des agents pathogènes comme Mycobacterium marinum, le plus proche parent de M. la tuberculose 2, ou Staphylococcus epidermidis, le responsable principal de biomatériau infection associée 3-5. Différentes voies d&#39;infection peuvent être utilisés dans embryons de poissons zèbres en fonction des besoins de l&#39;étude 6. L&#39;une de ces voies d&#39;infection est injection jaune des bactéries. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux autres est que le jaune infectile peut être effectuée automatiquement par l&#39;intermédiaire d&#39;injection de robot, ce qui réduit considérablement le temps d&#39;injection et qui permet une grande reproductibilité de l&#39;infection 7, 8. Des travaux antérieurs, en utilisant le poisson zèbre comme un débit élevé dans un système de modèle in vivo pour l&#39;étude de S. epidermidis et M. infection marinum a montré pour réussir 7, 8. Ce système est capable de dépister la progression de la maladie par injection de jaune de robot d&#39;embryons précoces et lecture en utilisant la fluorescence comme mesure de la charge bactérienne. En accord avec cette notion, cette configuration a été optimisé et mis en place un pipeline à haut débit très efficace avec le potentiel de générer un grand nombre d&#39;embryons infectés de façon homogène et suivre la progression de l&#39;infection pendant le temps après le traitement d&#39;un certain nombre de composés. Avec la configuration établie, il est possible de générer jusqu&#39;à 8.000 embryons synchrones à l&#39;écranpour la progression de la maladie, le traitement de cette façon jusqu&#39;à 2500 embryons par heure. Les embryons sont triées en fonction de leur charge bactérienne à l&#39;aide d&#39;un système automatisé, assurant groupes homogènes de larves infectées. En outre, afin de valider la configuration, les effets de référence connus pour empêcher la progression de la tuberculose chez des mammifères ont été testés sur des embryons infectés par M. souche E11 marinum ou la souche plus virulente M 9. Cette étude décrit en détail le pipeline à haut débit qui a été mis en place pour être en mesure de générer un grand nombre d&#39;embryons infectés et l&#39;analyse ultérieure de la progression bactérienne au cours du développement et après traitement avec le composé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Poisson zèbre sont de plus en un outil précieux dans la phase préclinique de projections de découverte de médicaments comme un modèle animal entier avec possibilités de criblage à haut débit. Ils peuvent être utilisés pour combler l&#39;écart entre les essais à base de cellules à des stades précoces et à la validation in vivo dans des modèles mammifères, ce qui réduit, de cette manière, le nombre de composés à l&#39;essai en passant par les modèles beaucoup plus coûteux de rongeurs. Dans cette lumière, dans le présent manuscrit est décrit un nouveau pipeline à haut débit en utilisant le poisson zèbre comme in vivo système modèle pour l&#39;étude de Staphylococcus epidermidis et infection de Mycobacterium marinum. Cette configuration permet la génération et l&#39;analyse d&#39;un grand nombre d&#39;embryons synchrones homogène infectés. En outre, la flexibilité de la canalisation permet à l&#39;utilisateur de mettre en œuvre facilement d&#39;autres plates-formes pour améliorer la résolution de l&#39;analyse en cas de besoin. La combinaison de l&#39;ensemble poisson-zèbre avec te innovant à haut débitchnologies ouvre le domaine du dépistage des drogues et de la découverte de nouvelles possibilités, non seulement en raison de la force de l&#39;aide d&#39;un modèle animal entier mais aussi en raison du grand nombre de lignées transgéniques disponibles qui peuvent être utilisés pour déchiffrer le mode d&#39;action des nouveaux composés.

Les présents résultats montrent que la canalisation à haut débit pour étudier S. epidermidis et M. infection marinum a été mis en place avec succès et que peut être étendu à d&#39;autres modèles d&#39;infection. Tout d&#39;abord, l&#39;utilisation de la grande cuve de reproduction (figure 1A), basé sur le système publié par Adatto et al. (2011) 11, permet de générer un grand nombre d&#39;œufs synchrones dans des événements uniques offrant un contrôle haute du processus de reproduction. Suivant pour pouvoir injecter grand nombre d&#39;embryons dans un court laps de temps, une version améliorée du système automatisé de micro-injection précédemment développé 7 a été utilisé (figure 1A). Pour évaluer ce qui est le meilleur stade de développement de l&#39;infection par le jaune, les injections avec S. epidermidis et M. marinum ont été effectuées à l&#39;ensemble des différentes étapes entre 1 512 et étage de cellule, conformément à la description faite par Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Injections avec 100 ufc S. epidermidis entre l&#39;étage 16 et 128 cellules à condition que le meilleur modèle d&#39;infection (figure 2). Les bactéries se multiplient à l&#39;intérieur du jaune pendant 3 jours et se propagent dans le corps à partir de 3 et suivants dpi. Exécution d&#39;injections avant le stade 16 cellules conduit à une forte mortalité de 4 ppp, et l&#39;injection après l&#39;étape de la cellule 256 a affiché une croissance principalement bactérienne dans le jaune d&#39;œuf avec presque pas de propagation des bactéries à l&#39;intérieur du corps de l&#39;embryon. La quantification de la charge bactérienne a été réalisée par une analyse de l&#39;intensité de fluorescence à l&#39;aide du cytomètre de flux grosse particule, comme décrit par Veneman et al. (2013) 8 (figure 3). Les observations ont montré que le stade optimal de développement pour l&#39;injection de 30 M. ufc marinum injection est comprise entre 16-128 étage de cellule de la souche E11 (figure 4A) et entre 16 à 64 stade de la cellule avec le M strai plus virulentn (figure 4B). Les embryons injectés à ces stades ont montré une croissance bactérienne à l&#39;intérieur du jaune d&#39;oeuf et la propagation des bactéries à travers l&#39;embryon (figure 7). L&#39;infection par les deux souches à des stades précoces présenté croissance bactérienne généralisée non spécifique conduisant les embryons de mourir après 4 dpi. D&#39;autre part, dans les embryons injectés à des stades ultérieurs de la charge bactérienne a été limitée au jaune. Ensuite, un tri préalable avec grande particule cytomètre de flux (figure 1B) a généré de grands groupes homogènes de poissons infectés à l&#39;exclusion des embryons non ou très infectées (figures 5a et 6a). Après un tri préalable, M. embryons infectés marinum ont été traités avec la rifampicine, un premier médicament antituberculeux ligne. Des études antérieures ont démontré que le traitement avec la rifampicine à une dose de 200 uM réduit efficacement M. infection marinum chez le poisson zèbre 7, 13. Prenant Advantage du grand nombre d&#39;embryons infectés de façon homogène générés avec le haut débit installation, le traitement avec des doses différentes a été effectuée. Les embryons infectés par M. marinum souche M et on traite pendant 48 heures avec 12, 24 et 200 uM de rifampicine ont montré efficace pour réduire l&#39;infection mycobactérienne d&#39;une manière dépendante de la dose (Figure 5B). Compte tenu de la réduction efficace de l&#39;infection en utilisant la rifampicine à une dose de 200 uM de cette concentration a été utilisé pour les expériences ultérieures. En ligne avec le résultat précédent, l&#39;étude de l&#39;évolution de la charge bactérienne à l&#39;aide M. souche marinum E11 une réduction significative de 24 heures et au-delà après traitement avec 200 uM rifampicine a été observée (figure 6B). En outre, si l&#39;imagerie à fort grossissement est nécessaire de ces embryons, ils peuvent être affichés automatiquement dans des plaques à 96 puits (figure 1C), d&#39;où les échantillons peuvent être analysés en utilisantle système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés au Grand particules Sampler monté sur un CLSM. Le système de technologie de contrôle automatisé des vertébrés au Grand Sampler de particules est un système qui peut être soit monté sur un microscope CLSM ou stéréo. Ce dispositif permet le chargement d&#39;embryons vivants ou fixes à partir d&#39;une plaque de 96 puits ou conteneur pour vrac automatiquement à travers un capillaire de verre, et l&#39;oriente en face de la caméra à l&#39;angle désiré (par exemple, dorsal ou latéral). Images de l&#39;embryon dans toutes les orientations peuvent être faites avec la caméra embarquée ou avec un CLSM externe (figure 7). Les embryons seront par la suite transférées dans le récipient de collecte ou de déchets. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Figure 1. Outl expérimental Mainstreamine. A) Les poissons adultes sont mis ensemble pour s&#39;accoupler, les oeufs sont recueillis, alignés dans une plaque d&#39;agarose et injectés. B) Les œufs injectés sont incubées à 28 ° C et seront pré-triés pour le possible traitement de la toxicomanie. C) L&#39;analyse ultérieure par grand particules cytomètre de flux et / ou Grande Sampler / vertébré technologie de contrôle automatisé de particules avec CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Figure 2. Mise en place de meilleur stade de cellule pour S. epidermidis jaune d&#39;injection. embryons de poisson zèbre ont été injectés dans le jaune à différents stades de développement de 1 à 512 stade de cellule avec 100 ufc de S. epidermidis. Les embryons injectés entre un 1e stade de 8 cellules a montré la croissance bactérienne dans le jaune et le taux élevé de mortalité de 4 dpi. Les embryons injectés entre 16 et 128 stade cellulaire ont montré une croissance bactérienne dans le jaune et l&#39;intérieur du corps à partir de 3 dpi. Embryons injectés entre l&#39;étape 256 et 512 cellules ont montré beaucoup la croissance des bactéries à l&#39;intérieur du jaune. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Figure 3. Quantification de la charge bactérienne en utilisant le flux des particules de grande cytomètre. 100 ufc de S. epidermidis ont été injectés dans le jaune d&#39;embryons de poisson zèbre. A) Jusqu&#39;à 5 dpi, chaque jour, des groupes de 10 embryons ont été homogénéisés et plaqué directement, montrant la croissance exponentielle moyenne basée sur deux répliques biologique (barres d&#39;erreur= SEM). B) Grand flux de particules cytomètre analyse montre le signal de fluorescence moyenne de non-injecté et S. epidermidis injecté embryons. 30-160 embryons par condition ont été analysés (barres d&#39;erreur = SEM), des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives par une ANOVA suivie par post-hoc test de Tukey (P &lt;0,001), ns:. Pas de différences significatives C) Corrélation entre ufc et signal de fluorescence moyenne des groupes de 10 S. epidermidis infecté embryons (barres d&#39;erreur = SEM). Ce chiffre a été modifié depuis Veneman et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Figure 4. Establishment de la meilleure scène de cellule pour M. marinum jaune injection. embryons de poisson zèbre ont été injectés à tous les différents stades de développement de 1 à 512 stade de cellule avec 30 ufc de M. marinum et M souche E11. A, B) Les embryons injectés 1-8 stade cellulaire a montré semblable d&#39;étalement et de la mortalité avec les deux souches. A) Les embryons injectés entre 16-128 étage de cellule de la souche E11 a montré la formation de granulomes et les infections systémiques, tandis que ceux injectés 256-512 stade cellulaire tenu de la charge bactérienne dans le jaune. B) Les embryons injecté entre 16-64 stade de cellule avec M souche a montré la formation de granulomes comme des structures et l&#39;infection systémique alors que ceux injectés 128-512 stade cellulaire conservé la charge bactérienne dans le jaune . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo: Content-width = &quot;5 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; Figure 5. Traitement de M. marinum infection aiguë avec un médicament anti-tuberculose de première ligne. embryons injecté entre 16-64 stade de cellule avec 30 ufc de M. marinum M souche ont été exécutés par la grande particule cytomètre de flux à 3 dpi être triés en deux groupes après avoir éliminé les non et / ou des embryons très infectées. A) fluorescence d&#39;embryons individuels dans les deux groupes. b) des embryons traités par la rifampicine (RIF ) pendant 48 heures à des doses de 12, 24 et 200 uM ont été analysés à 4 dpi; leur charge bactérienne est réduite de manière significative. C) des profils de COPAS représentatifs des embryons traités avec du DMSO et de la rifampicine à des doses de 12, 24 et 200 uM pendant 24 heures. Charge bactérienne et de la distribution est indiqué par les sommets rouges. La ligne bleue représente le profil de l&#39;élément trié (4 dpf poisson zèbre embryo) par les COPAS. 60-90 embryons par condition ont été analysés. Chaque point de données représente un embryon individuel. Les valeurs sont indiquées en tant que moyenne ± SEM. ns: non significatif différences. Analyse de la signification statistique des différences a été réalisée par un ANOVA suivi par le test posthoc de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Figure 6. Traitement de M. infection chronique marinum avec un premier médicament antituberculeux ligne. embryons injecté entre 16-64 stade de cellule avec 30 ufc de M. souche marinum E11 ont été exécutés par le flux des particules de grande cytomètre à 3 dpi être triés en deux groupes après avoir éliminé les non et / ou des embryons très infectées.<html> A) La fluorescence des embryons individuels dans les deux groupes. B) Les embryons traités par la rifampicine (RIF) à 200 uM pendant 4 jours ont été analysés montrant une réduction significative de la charge bactérienne après le 1er jour de traitement. 90 embryons par condition ont été analysés. Les valeurs sont indiquées en tant que moyenne ± SEM. Des lettres différentes indiquent des différences significatives entre les points dans le temps du même traitement. * Indique des différences significatives avec le groupe de contrôle. ns: non significatif différences. L&#39;analyse de la signification statistique des différences a été réalisée par une ANOVA suivie d&#39;un test posthoc de Tukey. (P &lt;0,05). Figure B) a été modifié depuis Spaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Figure 7. Résultat de M. injection de jaune marinum E11 imagée en utilisant la technologie de dépistage des vertébrés automatisé et CLSM. pile de Z confocale (cousu 3 images) d&#39;un 5 dpi FLI1-egfp 14 embryon. A) embryon en direct montrant la prolifération de M. bactéries marinum E11 (en rouge) dans tout le corps. B) fixe 5 dpi fli-egfp embryon montrant M. bactéries marinum E11 (en rouge) dans tout le corps co-localisation avec les leucocytes (bleu clair) détectée par L-plastin immunomarquage 15.

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Cet article décrit la vidéo pipeline à haut débit qui a été mis en place avec succès pour infecter et d&#39;analyser un grand nombre d&#39;embryons de poisson zèbre qui fournissent un nouvel outil puissant pour les essais en enclos et la découverte de médicaments à l&#39;aide d&#39;un organisme entier de animaux vertébrés.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K vues.  Leiden University.  Cet article décrit la vidéo pipeline à haut débit qui a été mis en place avec succès pour infecter et d'analyser un grand nombre d'embryons de poisson zèbre qui fournissent un nouvel outil puissant pour les essais en enclos et la découverte de médicaments à l'aide d'un organisme entier de animaux vertébrés. 

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recherche

Immunologie et infection

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilisation d&#39;<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un organisme modèle pour l&#39;étude<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Maladies infectieuses

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Faisant preuve d&#39;une multi-résistante<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification de puces à ADN

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse de 18FDG TEP/CT d’imagerie comme un outil pour étudier Mycobacterium tuberculosis Infection et traitement chez les Primates Non humains

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...