Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions cérébrales, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées de façon chronique, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectués. Le but ultime de l’optogénétique est la modulation des circuits neuronaux avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez l’animal qui se comporte.
Contrairement aux manipulations pharmacologiques ou électriques, l’optogénétique permet le contrôle précis de types de cellules spécifiques sur les circuits neuronaux. L’optogénétique est le moyen idéal de cibler des types de cellules spécifiques dans une région spécialement définie pendant le comportement, et d’examiner l’effet direct des changements dans ces microcircuits. Nous allons maintenant présenter une étape pour guider la façon de préparer et de planter et de conduire l’optogénétique chez une souris librement en mouvement.
Pour la préparation de l’implant optique, placez un côté plat de ferrule en céramique vers le haut dans un étau de banc. Dépouillez le code d’une fibre de verre de 200 micromètres de diamètre, avec un outil de décapage de fibre et coupez deux à trois centimètres non morceaux avec un scribe en fibre de céramique. Placez le morceau de fibre de verre dans la ferrule en céramique, puis placez une goutte d’une superglue sur le côté plat avec une injection cannular.
Sur le côté rond de la ferrule en céramique, couper la fibre de verre aussi court que possible et placer le pré-implant à une rondelle de polissage ferrule pour polir le côté rond sur quatre papiers d’édition différents. Ensuite, couper la fibre de verre sur le côté plat de la ferrule en céramique, à la longueur nécessaire à l’implantation. Utilisez un atlas du cerveau de souris pour calculer la longueur de l’implant.
L’implant doit se terminer directement au-dessus de la région d’intérêt. Avant l’implantation, l’anesthésie est appliquée. La technique précise et esthétique est décrite dans le manuscrit.
Lorsque la souris atteint un état profond d’anesthésie, placez-la sur une plaque chauffante et fixez la tête dans un cadre stéréotaxique. Fixer le nez et les dents à l’avant et les oreilles des deux côtés. Appliquez une algésie avec une tasse de coïnf subcuntaneously dans le dos de la souris et appliquez l’onguent opaque d’oeil sur les deux yeux pour les protéger du séchage.
Humidifiez les cheveux sur le cuir chevelu avec une serviette en papier humide, puis coupez-les à l’aide de ciseaux. Assurez-vous d’enlever tous les cheveux lâches avec une serviette en papier humide. Utilisez un bâton de coton pour désinfecter le cuir chevelu avec une teinture contenant de l’iode.
Soulevez le cuir chevelu sur la région d’intérêt avec une pince à épiler et coupez un centimètre le long de la ligne médiane. Pour malmener le crâne pour l’implantation, appliquer une petite quantité d’acide phosphorique sur la cicatrice et laisser prendre effet pendant 15 secondes. Retirer tout l’acide à l’aide d’un bâton de coton et rincer la cicatrice avec du chlorure de sodium deux fois.
Pour une injection appropriée, calculez le facteur F pour les coordonnées individuelles. Placez un cannular en verre dans le cadre stéréoctatique et localisez-le directement au-dessus du bregma. Maintenant, zéro le système de coordonnées et déplacer la canule en verre à Lambda.
Calculez le facteur F avec la formule suivante. Bregma moins Lambda divisé par 4,2 égale le facteur F. Les coordonnées exactes sont très importantes pour l’injection et l’implantation parce que sinon, si la mauvaise structure est stimulée, alors les effets comportementaux ne sont pas spécifiques.
Toutes les souris ont des écarts minimaux dans la taille de leur crâne, par conséquent, le coefficient est absolument obligatoire. Utilisez les coordonnées ajustées pour trouver l’emplacement de la cicatrice directement au-dessus de la structure d’intérêt. Utilisez une canule d’injection pour percer un trou dans le crâne, en faisant pivoter la canule sur place.
Pour prendre une solution virale dans la canule de verre reliée à la seringue, placez une goutte de chlorure de sodium sur le crâne et un morceau de pirophen sur le dessus. Placez une goutte de deux solutions de virus microlitres sur le pirophen et abaissez la pointe de la canule en verre dans le virus. Appliquez une pression négative et attendez que la solution virale soit prise par la canule.
Zéro à cette coordonnée lorsque la pointe du virus avec canule est au niveau du crâne et lentement l’abaisser dans le forage à la position la plus basse du côté de l’injection. Appliquer une petite quantité de pression positive avec la seringue jusqu’à ce que le ménisque soit abaissé. Laissez le virus se propager pendant deux à trois minutes avant de déplacer la canule en verre vers le haut à la position suivante.
Retirer la canule de verre très lentement et la jeter après l’injection finale. Maintenant, préparez le crâne pour l’implantation. Séchez le crâne avec de l’air comprimé, appliquez l’amorce avec ce bâton correspondant et laissez-le sécher pendant 15 secondes.
Appliquer le lien avec le même bâton et le guérir pendant 20 secondes avec la lumière UV. Placez l’implant dans le support correspondant et placez la pointe de la fibre de verre directement au-dessus du trou de forage et abaissez-la soigneusement. Arrêtez d’abaisser l’implant lorsque la valve restante de superglue touche le crâne.
L’implantation de fibres optiques peut également être faite pour des structures bilatérales comme l’hippocampe. Cela permet une légère stimulation dans les deux hémisphères en même temps ou permet la stimulation de deux structures différentes. Il est également possible d’injecter le virus à un endroit différent de l’implant de fibre optique.
Si l’injection et l’implantation se font dans différentes régions, percer tous les trous nécessaires après l’application d’acide phosphorique, mais avant l’adhérence des deux composants. Vérifiez à nouveau si le crâne est encore complètement sec, puis appliquer du ciment dentaire fluide autour de l’implant et dans les environs, puis guérir pendant 20 secondes avec la lumière UV Appliquer deux ciments plus moindres dans la zone complètement sans fourrure et séché crâne. Guérir chaque couche avec de la lumière UV.
Pour terminer la chirurgie appliquer l’onguent d’iode sur l’ensemble de la plaie. Relâchez la fixation du nez et de l’oreille, amenez la souris dans une cage fraîche et placez-la sous une lampe chauffante pour éviter la perte de chaleur corporelle. Vérifiez son état de santé au moins une fois par jour et il affichera l’opération et l’algésie après trois jours si nécessaire.
Après deux semaines de récupération, les souris peuvent être utilisées pour des expériences comportementales. Ouvrez le logiciel Pulser et sélectionnez le port USB com sur qui la source lumineuse est branchée. Choisissez le mode de fonctionnement trois pour permettre à un logiciel externe de contrôler la source de lumière.
Choisissez le réglage correct pour 20 stimulation Hertz avec impulsion lumineuse de cinq millisecondes. Pour localiser la division pour communiquer avec le pulseur, appuyez sur la séquence de démarrage. Ce statut restera jusqu’à ce que les expériences soient terminées.
Maintenant, créez une nouvelle expérience dans EthoVision XT, passez au fichier, choisissez nouveau à partir du modèle et sélectionnez appliquer un modèle prédéfini. Choisissez le suivi en direct et sélectionnez la caméra avec source et confirmez la came Puslar Gen-Eye connectée. Choisissez la souris comme animal qui doit être enregistré.
Sélectionnez le modèle d’arène, le carré de champ ouvert et le centre de modèle de zone, la bordure, les coins. Confirmez un sujet qui doit être suivi et sélectionnez le point central, le point avant et la base de la queue. Confirmez que la couleur de l’animal par rapport à l’arrière-plan est plus foncée et le taux d’échantillonnage recommandé pour terminer l’étape.
Nommez l’expérience appropriée et choisissez un emplacement à enregistrer. Jusqu’à ce que vous trouviez les paramètres de l’arène, la caméra ouvrira automatiquement une image de fond. Adaptez les zones prédéfinis à l’arène réelle en utilisant la flèche et les deux symboles sur sa droite.
Si certaines zones ne sont pas nécessaires, supprimez-les. Appuyez sur l’échelle de tirage pour calibrer et mettre une ligne d’un coin du labyrinthe à l’autre. Entrez la longueur de la distance réelle en centimètres.
Répétez cela pour l’autre axe. Pour définir les paramètres de contrôle d’essai, préparez la règle principale en ajustant le temps de condition à 20 minutes. La condition pour Star Trek devrait être, lorsque le sujet est dans l’arène pendant deux secondes, pour un état automatique du suivi lorsque la souris est dans l’arène.
Pour créer une sous-règle pour la stimulation de la lumière, allez aux structures, plus et sélectionnez sous-règle. Placez-le en dessous de la règle principale et étalez les deux boîtes. Aller à des conditions, le temps et lui donner un nom comme la lumière sur un, ajuster l’état est rencontré après cinq minutes.
Placez la boîte directement derrière la case de début de règle de la sous-règle. Passez à l’action du matériel personnalisé et nommez-le avec de la lumière sur un. Sélectionnez l’action pour effectuer comme: Je vais mettre un haut.
Placez la boîte directement derrière la boîte d’état. Répétez les étapes pour programmer la lumière à la lumière sur. Maintenant, allez aux structures, sous référence de règles et vérifiez que la référence appartient à la sous-règle correcte.
Choisissez les conditions de démarrage comme sans délai et les conditions de démarrage comme exécutez une fois par condition de démarrage. Placez la boîte de référence entre les livres supplémentaires un et les livres d’état deux de la règle principale. Définissez maintenant les paramètres de détection pour afficher au système ce qu’il doit suivre.
Placez un test miles dans l’arène et sélectionnez la configuration automatisée. Choisissez le rongeur comme type d’animal et utilisez le curseur de souris pour dessiner une boîte autour des souris dans l’arène. Confirmez les résultats de la question de soins avec oui.
Pour l’expérience en plein champ, apportez la souris expérimentale à la salle de comportement juste avant l’expérience pour assurer un niveau approprié d’anxiété. Couplez la souris être une fente de la source de lumière en appuyant doucement sur la grille de la cage. Placez-le dans une cage d’attente avec de la litière fraîche pendant 10 minutes pour vous acclimater au câble léger.
Commencez l’acquisition en appuyant sur le bouton stop et vous pour visionner XT. Transférer la souris de la cage d’attente dans le coin supérieur gauche du champ ouvert. Laissez le champ visuel de la souris pendant l’expérience et restez calme. Après 20 minutes, lorsque l’expérience est terminée, retirez la souris du labyrinthe, déconnectez le câble lumineux et remetez-la dans sa propre cage.
Par une visualisation de contrôle, les différences dans le temps central entre la lumière éteinte et la lumière sur les visages peuvent être directement vues. La souris passe moins de temps au centre lorsque la lumière est allumée. Pour l’expérience barnes labyrinthe, apporter toutes les souris expérimentales dans la salle de comportement autour d’une heure avant l’expérience.
Préparez le labyrinthe Barnes en fermant tous les trous sauf un, et maintenant qu’une boîte d’évacuation est placée. Connectez une souris dans la source lumineuse aux deux implants et placez-la directement au milieu du labyrinthe Barnes. Appuyez sur démarrer et besoin de visiter le prochain T et enlever la boîte en carton.
Soyez prêt à arrêter l’essai manuellement juste au cas où le logiciel ne reconnaît pas toute la transition. Sortez la souris du labyrinthe et retirez la connexion au câble lumineux. Lors de l’exécution, l’apprentissage et la tâche de mémoire, non seulement l’effet immédiat de la manipulation est étudié, mais aussi l’effet à long terme de la manipulation lors de l’acquisition, la consolidation ou la récupération.
Pour l’analyse des données, vous trouvez l’état de traitement traité ou contrôlé, allez à la nidification et sélectionnez l’état de contrôle d’essai. Choisissez l’intervalle d’état de l’action de l’élément Star Trek à la lumière d’action de l’élément s’allume sur un. Placez le nichoir entre le traitement de la boîte de filtre et la boîte de résultat correspondante.
Cet intervalle défini est d’un. Répétez les étapes pour les intervalles sur l’un des deux et sur deux ainsi que pour le groupe témoin. Définissez également les paramètres à analyser dans le profil d’analyse.
Choisissez la variable dépendante dans la zone et sélectionnez le centre de zone, le point du corps, le point central, et aller sur les statistiques d’essai. Sélectionnez la fréquence, la durée cumulative, et laissez-le voir le premier. Ajoutez également le déplacement de distance comme variable.
Avec ce profil, les données pour le temps passé dans le centre, les entrées du centre et dit de se déplacer à distance est disponible. Pour extraire des données de chaque division, aller aux résultats et sélectionner des statistiques et des graphiques, appuyez sur calculer pour voir les données analysées. Appuyez sur les données d’exportation et sélectionnez les statistiques d’essai et l’emplacement à enregistrer.
Les données exportées sont enregistrées sous forme de fichier Excel et avec des valeurs individuelles pour chaque souris. En outre, allez à la visualisation de la carte thermique et appuyez sur les cartes thermiques des parcelles, sélectionnez des essais sur la droite pour voir des cartes thermiques individuelles pour chaque souris et essai. Faites un clic droit sur la souris et exportez les cartes thermiques sous forme d’images.
Plus tard, ouvrez le fichier Excel de l’ordinateur et de calculer la moyenne et standard euros SCM pour les quatre essais et tous les groupes de conditionnement mesuré. Pour générer des graphiques et l’intrigue Sigma, copiez les moyens et SCM dans l’ordre correct du fichier supplémentaire à l’intrigue Sigma. Les lignes doivent contenir les données pour off un, sur un, et les colonnes contiennent essai, moyenne et SCM hertz.
Sélectionnez les trois colonnes et allez créer des graphiques. Sélectionnez la boîte à barres et choisissez la boîte non groupée avec flèche. Étiquetez l’ensemble du graphique, rentrez chez vous, sélectionnez la boîte graphique et pressez l’exportation.
Sélectionnez le dossier destination et choisissez meta file comme format. Pour calculer les statistiques pour les données obtenues, copiez les données à droite de Xcel sur un contre un, et cetera, et à des colonnes simples de l’intrigue Sigma. Marquez les colonnes que vous souhaitez comparer et passez à l’analyse, choisissez le test T et appuyez sur exécuter.
Enfin, les données comportementales peuvent être affichées divisées en let off et à l’essai avec une spécialisation supplémentaire de carte thermique. Dans l’expérience en plein champ, pendant la stimulation lumineuse de Channelrhodopsin2 et les neurones pyramidaux, la durée du centre est diminuée, ce qui indique des niveaux d’anxiété accrus. Par immunohistochimie, le site d’injection et l’expression du virus peuvent être déterminés, également à la spécificité à la ligne spéciale de souris cre-dépendante peut être validée.
On peut clairement voir que la stimulation lumineuse de Channelrhodopsin2 améliorer les neurones de l’esprit de cette région spécifique du cortex augmente les niveaux d’anxiété, par rapport à l’anxiété de base avant cette stimulation. Cet effet immédiat de la manipulation sur le comportement est la raison pour laquelle optogénétique est utilisé aujourd’hui pour tant de questions de recherche concernant le comportement. Cette procédure peut être utilisée pour la modulation optogénétique de n’importe quel type de cellule désiré ou circuits neuronaux dans le cerveau de la souris.
En combinant cette procédure avec des tests comportementaux appropriés pour votre recherche, un aperçu plus approfondi des circuits neuronaux impliqués dans les comportements et les maladies d’intérêt peut être acquis.
