Le protocole actuel contribue à l’étude des mécanismes cérébraux sous-jacents au comportement moteur qualifié. L’optogénétique sans fil permet la manipulation de neurones spécifiques pendant que les sujets effectuent une tâche en mouvement libre. En combinaison avec la vidéographie à grande vitesse, il est possible d’avoir une analyse détaillée du comportement de la motricité fine.
La méthode pourrait aider à comprendre les problèmes moteurs dans les troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Ces techniques peuvent également être utilisées pour étudier la fonction cérébrale dans d’autres paradigmes comportementaux. Diana Rodriguez-Munoz, une étudiante de premier cycle de mon laboratoire, participera à l’expérimentation.
Pour les interventions chirurgicales, commencez par préparer une canule LED de la longueur souhaitée en fonction des coordonnées dorso-ventrales de la structure d’intérêt. Pour ce faire, coupez la fibre de verre à une longueur supérieure à la taille finale souhaitée et broyez la pointe de la fibre à la longueur cible avec du papier de verre rugueux. Ensuite, polissez la pointe de la fibre avec du papier de verre fin.
Pour les microinjections, remplissez une pipette avec l’huile minérale et placez la pipette dans le micro-injecteur. Assurez-vous que le micro-injecteur fonctionne correctement en injectant de l’huile minérale. Ensuite, préparez la souris anesthésiée pour la chirurgie en appliquant une pommade ophtalmique et en enlevant les poils du cuir chevelu avec une tondeuse et une crème dépilatoire.
Ensuite, essuyez le cuir chevelu avec des cotons-tiges contenant 8% d’iode povidone et 70% d’éthanol alternés trois fois chacun. Après la désinfection, placez la souris dans l’appareil stéréotaxique et fixez la tête en veillant à ce que le crâne soit nivelé dans les axes médial-latéral et antérieur-postérieur. Utilisez un scalpel pour faire une incision d’un centimètre à travers le cuir chevelu au niveau des yeux le long de l’axe sagittal.
Ensuite, rétractez la peau pour exposer le crâne et nettoyez le périoste avec des cotons-tiges. Nettoyez la surface du crâne avec une solution saline et des cotons-tiges et résolvez tout saignement à la surface à l’aide de lances oculaires absorbantes stériles. Ensuite, appliquez une goutte de peroxyde d’hydrogène à 2,5% avec un coton-tige et laissez-le agir pendant quelques secondes pour rendre les sutures du crâne visibles et avoir une meilleure référence.
Après quelques secondes, nettoyez soigneusement la zone avec un coton-tige propre. Avec une pipette en verre de 15 microns de diamètre final de la pointe, localisez bregma et lambda pour vérifier que le crâne est nivelé dans l’axe antérieur-postérieur. Ensuite, peignez un point de référence dans le cuir chevelu au-dessus des coordonnées sélectionnées avec un marqueur.
Dans le point de référence, effectuez une craniotomie d’un millimètre de diamètre en appliquant une légère pression sur le crâne avec un outil rotatif à une vitesse faible à moyenne avec un petit foret dentaire rond. Une fois cela fait, déplacez le capillaire vers les coordonnées antérieures-postérieures, ou AP, et médiale-latérales, ou ML, sélectionnées. Chargez le capillaire avec 300 à 400 nanolitres du virus adéno-associé dépendant de CreE, ou AAV, comme AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry pour exprimer la channelrhodopsine dans la région d’intérêt.
Un AAV peut être utilisé comme témoin pour exprimer la protéine rapporteure. Après vous être assuré que la pointe n’est pas bouchée, introduisez la pipette en verre dans le cerveau aux coordonnées dorso-ventrales moins 3,35 millimètres dans le striatum dorsal-latéral et injectez 200 nanolitres du virus à l’aide d’un injecteur automatique à raison de 23 nanolitres par seconde. Attendez 10 minutes après l’injection avant de retirer lentement la pipette en verre pour éviter tout déversement.
Ensuite, nettoyez et séchez tous les résidus avec des cotons-tiges. Ensuite, fixez la canule LED en verre au bras stéréotaxique et calibrez les coordonnées en utilisant bregma comme référence. Ensuite, insérez la canule lentement pour éviter les dommages tissulaires et placez-la à 100 micromètres au-dessus du site d’injection.
Une fois la canule LED en place, ajoutez une goutte de 100 microlitres d’adhésif tissulaire au bord de la craniotomie. Utilisez une brosse stérile pour appliquer un mélange de ciment dentaire fraîchement préparé autour du connecteur de la canule petit à petit, en construisant des couches jusqu’à ce que le crâne soit recouvert et que le connecteur soit solidement attaché au crâne, laissant les broches complètement libres. Lorsque le ciment sèche complètement, fermez la peau autour de l’implant à l’aide d’un adhésif tissulaire.
Ensuite, placez la souris dans une cage de récupération au-dessus d’un coussin chauffant à 33 degrés Celsius tout en surveillant les signes d’inconfort ou de douleur. Enregistrez le comportement de l’animal avec une caméra régulière et capturez 30 à 60 images par seconde depuis l’avant de la chambre. Un miroir peut être placé sous la chambre d’entraînement à un angle de 45 degrés pour surveiller la posture de l’animal.
Lorsque les souris commencent à atteindre la pastille, tournez la canule LED manuellement avec la télécommande pour avoir une stimulation continue pendant la durée du comportement pendant une durée maximale de deux secondes. Le dispositif de stimulation déclenche une LED de 470 nanomètres avec une intensité à la pointe d’un milliwatt par millimètre carré. Le comportement moteur fin de l’animal sous manipulations optogénétiques a été étudié avec la tâche de portée à saisir.
Les souris ont appris à exécuter la tâche en quelques jours et ont atteint une précision de plus de 55%, atteignant un plateau après cinq jours d’entraînement. La trajectoire des mouvements a été suivie avec une vidéographie à grande vitesse, ce qui a permis d’analyser la cinématique. L’évaluation quantifiable de paramètres tels que la distance parcourue, la vitesse, l’accélération, le point final et la trajectoire a été effectuée.
Dans les essais manqués, les souris ont commencé le mouvement de préhension plus loin de la pastille que les essais frappés. De plus, des erreurs ont été significativement associées à la posture de la souris, comme en témoignent les différences d’angle corporel lors des essais frappés et manqués. L’activation controlatérale de la dopamine D1 exprimant des neurones de projection épineux, ou SPN, a réduit le succès de préhension par rapport aux conditions de contrôle.
Lors d’une stimulation optogénétique, la trajectoire de la patte a augmenté dans la distance parcourue, ce qui a conduit à l’incapacité de cibler la pastille et à une augmentation de l’erreur initiale de type un. L’analyse en composantes principales, ou APC, a montré que toutes les trajectoires des essais au cours de l’activation des PAN D1 controlatérals se séparaient en un groupe avec presque aucun chevauchement avec le groupe témoin, ce qui indique une faible similitude. L’activation des DSPN dans la partie ipsilatérale a conduit à une augmentation de la dispersion de trajectoire montrée par l’analyse PCA.
Par conséquent, l’activation ipsilatérale des SPN D1 a modifié la trajectoire d’atteinte sans modifier le résultat comportemental. Lorsque vous effectuez ce protocole, veillez à placer correctement la canule afin qu’elle ne se détache pas pendant les séances d’entraînement. Cette méthode peut être utilisée dans d’autres paradigmes comportementaux pour étudier le comportement moteur, le traitement sensoriel, l’apprentissage et la mémoire.
L’optogénétique sans fil permettra d’étudier le comportement naturaliste et ses fondements neurobiologiques chez des sujets vraiment en mouvement libre.
