Nous fournissons ici un protocole détaillé pour évaluer les propriétés enrichissantes ou aversives de la stimulation génétique d’une région spécifique du cerveau. La technique peut répondre rapidement si la stimulation de cellules spécifiques est gratifiante ou aversive. Nous décrivons la configuration pour stimuler la zone tegmentale ventrale, mais nos protocoles peuvent facilement être adaptés pour changer des paramètres spécifiques en termes de différentes régions étudiées.
Pour commencer, utilisez des microcontrôleurs à bord unique pour contrôler la source laser. Chargez le script sur la carte de microcontrôleur à l’aide du câble de connexion approprié à l’ordinateur. Le script inclut la modulation externe provenant du logiciel de suivi à travers une boîte TTL, et une sortie au laser pour contrôler les paramètres de stimulation.
Utilisez un câble réseau pour connecter la boîte TTL à la carte. Assurez-vous que le laser est réglé pour contrôler par modulation externe, et connecter le laser à la carte à l’aide d’un câble FC / PC. Connectez les broches appropriées aux parties au sol de la planche.
Pour connecter la source laser à la fibre optique, connectez d’abord la source laser à un joint rotatif. Connectez un cordon patch à l’articulation rotative. Stabiliser l’articulation rotative au-dessus de l’appareil, mais à l’extérieur de la zone d’enregistrement.
Assurez-vous que la longueur du cordon de patch à fibre optique est appropriée pour permettre à la souris de se déplacer sans difficultés dans l’arène. Pour calibrer la configuration de l’arène, utilisez une règle pour mesurer une partie spécifique de l’appareil physique. Dans le logiciel, tracer une ligne correspondant à la partie mesurée.
Sous l’onglet Draw Scale to Calibrate, entrez la valeur déjà connue. Concevez l’arène, dessinez la zone où le mouvement des souris sera enregistré. Créez les zones, dessinez les zones qui seront éventuellement assignées en tant que laser-appariés, laser-non appariés, et neutres.
Appuyez sur le bouton Valider la configuration pour valider la configuration pour confirmer qu’il n’y a pas de paramètres contradictoires, par exemple, les zones en dehors de l’arène. Assurez-vous que le contrôle matériel est activé et réglez l’heure de l’expérience à 30 minutes, à l’option til répétée dans les paramètres de la boîte de référence. Assignez un compartiment en tant qu’appariement laser, dans lequel l’entrée de la souris déclenchera un signal TTL à travers le logiciel de suivi à la carte de microcontrôleur dans les paramètres de condition.
Pour modifier la configuration de l’approche de préférence du compartiment neutre, après la configuration de l’arène et du temps, attribuez les zones A et B comme étant jumelées au laser en ajoutant lorsque le point central se trouve dans l’une des zones A et B pour la boîte d’état liée aux paramètres des compartiments A et B. Pour configurer les paramètres de détection, utilisez un mannequin pour ressembler à la souris. Placez le mannequin dans un compartiment de l’appareil, et utilisez la configuration automatisée avec soustraction dynamique.
Retirez le mannequin et placez-le dans le compartiment opposé. Assurez-vous que le mannequin est entièrement détecté. Placez le mannequin dans le compartiment couplé au laser.
Pour vérifier si la stimulation fonctionne, commencez l’acquisition en utilisant les paramètres de contrôle d’essai précédemment configurés et voyez si la stimulation est déclenchée comme il se doit. Ensuite, placez le mannequin dans le compartiment non apposé ou neutre, et voir si la stimulation est arrêtée. Utilisez le bouton sur le laser pour régler la puissance laser à 10 milliwatts.
Connectez l’implant à fibre optique au cordon de patch à fibre optique à l’aide d’un manchon en céramique et placez la souris dans le compartiment neutre de l’appareil à trois compartiments. Attendez que la souris soit détectée par le logiciel. Retirez les portes coulissantes verticales qui empêchent l’animal d’entrer dans les compartiments principaux.
Laissez l’animal explorer librement sans aucune perturbation. L’expérience de préférence en temps réel se déroule tout au long de huit sessions. Des souris de DAT-Cre injectées avec le virus d’EYFP de channelrhodopsin d’AAV dans la région tegmental ventrale ont été examinées pour cibler des neurones dopaminergiques.
Les souris ont passé en moyenne environ 70% de leur temps dans le compartiment couplé au laser, par opposition au compartiment non apparié à 20% et le compartiment neutre à 10%Un phénotype comportemental opposé a été observé avec des souris Vglut2-Cre injectées avec AAV channelrhodopsin EYFP dans la zone tegmental ventrale. Les souris ont évité le compartiment jumelé à la stimulation, et ont passé plus de temps dans le non-apparié. Pendant les jours conditionnés de réponses cinq et huit, les souris n’ont pas montré un évitement clair du compartiment précédemment jumelé.
Pour démontrer davantage le rôle gratifiant ou aversif de neurones spécifiques, la méthode décrite peut être complétée par d’autres méthodes telles que les paradigmes operon, ou la substimulation photogénétique. Faites attention lors de la manipulation des virus et lorsque vous utilisez des sources laser.
