En utilisant ce protocole, les tranches de tissu ventriculaire gauche humain peuvent être cultivées ex vivo dans une chambre biomimétique. L’application de pré et post-charges améliore la ressemblance de l’environnement physiologique. Cette technique permet l’enregistrement continu de la contraction tissulaire.
Les protocoles de stimulation définis par l’utilisateur permettent d’évaluer les paramètres de contraction vitaux tels que la potentialisation post-pause, le seuil de stimulation, la relation force-fréquence et la période réfractaire. La culture à long terme de tranches myocardiques, en utilisant cette configuration, ouvrira la voie à de futures recherches ex vivo, facilitant ce dépistage des effets thérapeutiques et cardiotoxiques des médicaments en médecine cardiovasculaire. Pour commencer, immergez les chambres de culture et les électrodes de graphite dans un litre d’une solution d’isopropanol à 10% et agitez pendant la nuit.
Le lendemain, transférer les chambres dans une solution à 100% d’isopropanol pendant 3 minutes, puis laisser sécher à l’air les chambres et les électrodes en graphite sous une hotte à écoulement laminaire. Fixez un circuit imprimé à chaque chambre en fonction des positions disponibles sur la bascule. Placez deux électrodes en graphite sur la carte de circuit imprimé conformément aux instructions du fabricant, puis placez un couvercle de boîte de Petri de 35 millimètres sur la chambre pour éviter toute infection.
Ensuite, remplissez le plateau de coupe jusqu’à 90 à 95% avec un tampon de tranchage. Transférer l’échantillon de tissu dans une boîte de Petri de 100 millimètres remplie de tampon de tranchage à froid et placer la boîte sur une plaque de refroidissement à 4 degrés Celsius. Enlevez les trabécules endocardiques en tenant l’endocarde avec une pince à épiler, puis utilisez des ciseaux pour couper environ 3 millimètres de tissu endocardique.
Fixez l’échantillon de tissu coupé, côté endocardique jusqu’à un patch en caoutchouc de 2 centimètres sur 2 à l’aide de quatre aiguilles de calibre 20 de 0,9 x 70 millimètres fixées en position carrée. Assurez-vous que le bord diagonal de chaque pointe d’aiguille pointe vers l’intérieur, ce qui améliore la fixation et prévient les dommages au myocarde. À l’aide d’un scalpel, coupez tout l’excès de tissu à l’extérieur des quatre carrés d’aiguilles.
À l’aide d’une pince à épiler, placez l’échantillon coupé sur un morceau de tissu stérile pendant 10 secondes pour éliminer l’excès de tampon de tranchage. Ensuite, retirez la seringue d’agarose du bain-marie et immergez l’échantillon dans de l’agarose. Laissez l’agarose se solidifier pendant cinq minutes sur une plaque de refroidissement.
La face endocardique de l’échantillon doit être visible dans l’agarose. À l’aide d’une pince à épiler, placez le côté épicardique de l’échantillon contenu dans l’agarose sur la zone collée, puis appuyez doucement sur l’échantillon contenant de l’agarose par le haut avec un outil émoussé sans couper ou endommager l’agarose. Laissez la colle se solidifier pendant 1 minute.
Réglez l’amplitude de vibration sur 1 millimètre, la vitesse de coupe initiale sur 0,07 millimètre par seconde et l’épaisseur de la tranche sur 300 microns. Après avoir connecté le système de culture à un ordinateur, démarrez le logiciel correspondant. Réglez la vitesse de la bascule à 60 tr/min et préréglez les paramètres de stimulation.
Pour les tranches cardiaques humaines, réglez la stimulation standard sur des impulsions biphasiques avec 50 milliampères ou un courant composé de 3 millisecondes de courant positif, de 1 milliseconde de pause et d’une impulsion de 3 millisecondes de courant inversé à une vitesse de stimulation de 30 battements par minute ou bpm, puis vérifiez les indicateurs d’électrode du logiciel et vérifiez que les électrodes des chambres de culture fonctionnent correctement. À l’aide d’une pince à épiler, séparez l’agarose du tissu. Évitez de toucher le tissu et manipulez-le avec précaution car tout dommage au tissu réduira le taux de réussite de la culture.
Pour fixer deux triangles en plastique à un échantillon, placez 1 microlitre de colle sur un couvercle stérile de boîte de Pétri. Utilisez une pince à épiler pour ramasser un triangle en plastique autoclavé. Trempez rapidement le bord avant du triangle dans la colle et collez le triangle sur l’échantillon perpendiculairement à l’alignement des cardiomyocytes.
Répétez l’opération pour l’autre triangle. À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu dépassant la largeur du triangle et replacez la tranche avec les deux triangles montés dans le plateau de coupe contenant le tampon de tranchage. Retirez la chambre de culture moyennement remplie de l’incubateur.
Sélectionnez une tranche préparée et insérez-la dans la chambre en connectant un triangle à chaque broche. Ajustez la distance entre les broches de montage à la taille de l’échantillon. Assurez-vous que l’échantillon est immergé dans le milieu.
Après avoir placé la parabole sur la bascule, diminuez la précharge en tournant la vis de réglage dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la ligne de base du graphique correspondant sur l’écran de l’ordinateur ne change plus, puis augmentez soigneusement la précharge ou la tension en tournant la vis de réglage dans le sens des aiguilles d’une montre. Pour les chambres à rigidité élevée, continuer jusqu’à ce que la ligne de base correspondante dans le graphique ait augmenté de 1 000 à 1 200 unités correspondant à une précharge d’un millinewton. Après avoir préparé le milieu de culture frais, préchauffez le milieu dans un bain-marie ou un incubateur à air chaud à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes.
Retirez le milieu de la chambre, en laissant environ 0,8 millilitre dans la chambre, puis ajoutez 1,6 millilitre de milieu frais à la même chambre, ce qui donne un volume total de milieu à 2,4 millilitres par chambre. Enfin, replacez le couvercle de la chambre et placez la chambre de culture dans sa position respective. La lecture de la contraction de cinq tranches du myocarde au cours d’une stimulation typique consistait en quatre sections distinctes de potentialisation post-pause, de seuil de stimulation, de relation force-fréquence et de période réfractaire.
Par rapport au contrôle, la force de contraction des tranches traitées avec des antagonistes du calcium, la nifédipine et la calciseptine, a diminué en 10 minutes. En revanche, l’agoniste des canaux calciques voltage-dépendants, Bay-K8644, a augmenté la force de contraction. La potentialisation post-pause des tranches témoins et traitées a été évaluée pour la libération intracellulaire de calcium du réticulum sarcoplasmique.
La tranche de contrôle n’a montré aucune modification. En présence de calciseptine et de nifédipine, l’inhibition des canaux calciques de type L a conduit à la potentialisation de la première contraction après une pause de 50 secondes, reflétant une contribution relative plus élevée de la libération intracellulaire de calcium à la contractilité totale. L’effet inverse a été observé avec Bay-K8644, qui stimule l’entrée du calcium extracellulaire via les canaux calciques de type L.
Dans l’analyse des relations force-fréquence, aucun changement n’a été observé dans la tranche témoin. Le traitement à la calciseptine n’a pas modifié la capacité de la tranche à suivre les stimuli lors d’une augmentation de la fréquence de stimulation lors de la comparaison des données avant et après le traitement. Par rapport à la calciseptine, la nifédipine a empêché une augmentation de la contractilité à des taux de stimulation plus élevés et a réduit le taux de capture maximal à 80 bpm.
Avec Bay-K8644, une augmentation de la force de contraction à des fréquences de stimulation très basses a été observée. Cependant, à des fréquences supérieures à 50 bpm, la force de contraction était inférieure à celle de la condition de prétraitement. Les tissus excisés doivent être rapidement transférés à une cardioplégie de 4 degrés.
Après le tranchage, les triangles en plastique doivent être fixés perpendiculairement à la direction de la fibre. La précharge ne doit pas dépasser 1500 millinewton. La culture de tranches biomimétiques peut aider les chercheurs à utiliser des manipulations génétiques ainsi que des thérapies cellulaires pour étudier la régénération et la réparation du myocarde humain adulte.
