Ce protocole donne des conseils précis, étape par étape pour moulage de la vascularisation artérielle pulmonaire chez les souris adultes et postnatales précoces. Cette technique permet aux utilisateurs de lancer entièrement l’ensemble du réseau vasculaire pour la visualisation par une variété de méthodes, y compris micro-CT, tout en maintenant l’intégrité des tissus mous. Cette technique est particulièrement utile pour examiner la morphologie pulmonaire-vasculaire et l’architecture, mais peut facilement être adaptée pour le ciblage d’autres lits vasculaires.
Comme beaucoup de chirurgies et de dissections, il n’y a pas de substitut pour visualiser réellement une procédure, et les téléspectateurs peuvent bénéficier de voir certaines des manœuvres les plus difficiles en cours d’effectuer. Une fois que le processus xiphoïde est exposé, saisissez doucement et élevez la cage thoracique. Faites soigneusement une incision dans le diaphragme semi-transparent, maintenant exposé.
Les poumons s’effondreront visiblement et s’éloigneront du diaphragme. Après avoir exposé le poumon et la trachée, enfilez 15 centimètres de tube PE10 sur le moyeu d’une aiguille de calibre 30. Et attachez cette unité à une seringue d’un millilitre, contenant 10 à la 4 molaire de nitroprusside de sodium, dans PBS.
Avancez le piston pour amorcer le tube jusqu’à ce que tout l’air ait été purgé. Comme une alternative efficace au texte, pénétrer l’apex du cœur d’un côté, et passer le bout des forceps incurvés à travers le muscle, et de l’autre côté du tissu. Saisissez une extrémité d’une longueur de 10 centimètres de soie 7-0, et tirez environ deux centimètres à travers le tissu.
Après avoir lété la suture, utiliser les huit centimètres restants de suture pour tirer le cœur caudally. Et scotchez la fin de la suture à la planche chirurgicale. Accrochez les extrémités des forceps incurvés sous l’aorte ascendante et le tronc d’artère pulmonaire.
Et tirez une longueur de trois centimètres de soie 7-0 à travers l’ouverture pour créer une suture lâche d’un seul jet. Utilisez des ciseaux pour faire une incision d’un à deux millimètres vers l’apex du cœur, pénétrant le ventricule droit à paroi mince. Et introduire le tube amorcé dans le ventricule droit, avançant doucement le cathéter dans le tronc de l’artère pulmonaire semi-transparente et à paroi mince.
Vérifiez visuellement que le cathéter n’a pas avancé dans les branches pulmonaires gauche ou droite, et n’a pas d’abord le point de branche de l’artère pulmonaire. Collez la partie distale du tube à la planche chirurgicale, et serrez doucement la suture lâche autour des deux grands navires. Couper le morceau de suture de huit centimètres pour remettre le cœur à une position de repos naturelle.
Et couper l’oracle gauche du cœur pour permettre au perfusate de sortir de la vascularisation. Ensuite, utilisez une pompe à seringues, pour infuser le nitroprusside de sodium à un débit de 0,5 ml/min à la fois pour rincer le sang, et pour dilater au maximum la vascularisation, jusqu’à ce que le perfusate s’écoule clairement. Pour construire l’unité d’inflation pulmonaire, coupez le cathéter intraveineux flexible de calibre 24 d’une baignoire et connectez-vous à l’aiguille d’un ensemble d’infusion de papillons.
Attachez cette unité au robinet d’arrêt et attachez le robinet d’arrêt à une seringue ouverte de 50 millilitres. Après avoir chargé la seringue de formaline et amorcé le cathéter, le robinet fermé, placez la seringue dans un support d’anneau, au point où le ménisque se trouve à 20 centimètres au-dessus de la trachée. Placez deux sutures lâches, de deux à quatre millimètres l’une de l’autre, inférieures au cartilage cricoïde, et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans le ligament cricothyroïde, supérieure aux sutures.
Insérez le cathéter dans l’ouverture et avancez la pointe au-delà des deux sutures lâches. Serrez les sutures autour de la trachée et ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre à la formaline d’entrer dans les poumons par gravité. Attendez cinq minutes pour que les poumons se gonflent complètement.
Si les poumons adhèrent à la cage thoracique pendant l’inflation, utilisez des forceps à pointe émoussée pour saisir l’extérieur de la cage thoracique et déplacez les côtes dans toutes les directions pour aider à libérer les lobes sans entrer en contact direct avec les poumons. Après cinq minutes, rétractez le cathéter derrière la première suture et ligate. Puis rétractez le cathéter derrière la deuxième suture et ligate.
Les poumons doivent maintenant être gonflés dans un état fermé et sous pression. Pour jeter la vasculature, chargez un millilitre d’une solution 8-1-1 d’agent curateur diluant polymère dans une seringue d’un millilitre. Et insérez soigneusement le piston.
Avec la seringue inversée, déprimez le piston pour enlever l’air, et pour permettre la formation d’un ménisque à l’extrémité de la seringue. Retirez la seringue nitroprusside de sodium du moyeu de l’aiguille et égoutter l’ajout de PBS dans le moyeu, pour créer un ménisque. Joignez la seringue composée de polymères au moyeu et commencez l’infusion à 0,02 millimètre par minute.
Surveillez le composé pendant qu’il se déplace librement à travers le tube, notant le volume de seringue pendant qu’il entre dans le tronc pulmonaire d’artère. Continuez la profusion jusqu’à ce que tous les lobes soient complètement remplis, jusqu’au plus petit récipient. Arrêtez la pompe, et une fois de plus, notez le volume de seringue.
Couvrez les poumons d’un lingette nettoyant à fibres optiques et appliquez généreusement le PBS. Laisser reposer l’échantillon intact de 30 à 40 minutes à température ambiante. Une fois que le composé polymère est guéri et durci, couper les membres et la moitié inférieure de la souris.
Et placez la tête et le thorax dans un cône de 50 millilitres rempli de formaline tamponnée à 10%, pendant la nuit. Le lendemain matin, saisissez la trachée pour séparer doucement l’unité cardiaque et pulmonaire de la cage thoracique et du thorax restants. Placer le bloc de tissu récolté dans un flacon de scintillation rempli de formaline.
Un casting réussi se traduira par un remplissage uniforme de l’ensemble du réseau artérielle pulmonaire. S’il y a des dommages aux voies respiratoires pulmonaires ou pulmonaires, de petites fuites empêcheront les poumons de tenir la pression. Le remplissage inégal ou incomplet peut résulter d’un sas à la suite de l’introduction d’air dans le système vasculaire par l’intermédiaire du cathéter, bloquant le flux en aval du composé.
Le sous-remplissage se produit lorsque trop peu de composé est introduit dans la vascularisation. Alternativement, le remplissage excessif, ou l’introduction trop de composé de polymère trop rapidement, peut causer la rupture artérielle, ou, plus généralement, le transit veineux. L’avancement du cathéter trop bas dans le tronc pulmonaire peut causer la pointe de coincer dans une branche de l’artère pulmonaire, créant un déséquilibre dans le flux, et provoquant un côté à remplir plus vite que l’autre.
La performance soigneuse de la technique comme démontré, utilisant la surveillance directe appropriée des points d’extrémité distal de vasculature, et les taux standard d’infusion peuvent avoir comme conséquence le remplissage optimal de la vascularisation pulmonaire. En outre, l’adaptation de cette technique à la vascularisation systémique peut donner des résultats tout aussi favorables dans d’autres lits vasculaires. Après coulée, les échantillons peuvent être traités pour la numérisation de la tomographie micro-calculée.
Pour le post-traitement, un logiciel commercial peut être utilisé pour générer un rendu en volume 3D de l’arbre pulmonaire-vasculaire. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, soyez particulièrement prudent autour des poumons fragiles, et l’artère pulmonaire. Plus important encore, évitez d’introduire de l’air dans le circuit vasculaire.
Après un casting réussi, un échantillon peut être scanné par micro-CT, et des questions impliquant la morphométrie vasculaire et l’architecture peuvent être explorées.
