Ce protocole a permis de répondre à une question importante dans le domaine des métastases cancéreuses. Y compris, comment les cellules tumorales colonisent le poumon? Comment les cellules tumorales restent-elles dormantes?
Et ce qui les incite à sortir de la dormance et éventuellement à former des métastases. Le principal avantage de ce protocole est que le processus métastatique dynamique peut être directement étudié in vivo, en temps réel, dans un microenvironnement réel. Cette méthode peut fournir un aperçu de plusieurs maladies pulmonaires, mais elle est particulièrement utile pour comprendre le comportement des cellules tumorales individuelles qui se propagent au poumon, un site commun de métastases.
Pour commencer, utilisez une suture de soie 2-0 pour nouer un nœud à la base d’un cathéter de calibre 22, en laissant des queues de 2 pouces de long. Une fois que la souris est complètement anesthésiée, déplacez la souris vers la table d’opération, intubez la souris, puis fixez le cathéter d’intubation en attachant la suture de soie 2-0 autour du museau de la souris. Connectez le ventilateur au cathéter d’intubation.
À l’aide de ruban adhésif en papier, fixez les membres antérieurs crâniens et postérieurs caudalement au stade chirurgical chauffé. Placez un ruban de papier le long du dos de la souris pour maximiser l’exposition au champ chirurgical. Soulevez la peau avec la pince et faites une incision circulaire d’environ 10 mm à environ 7 mm à gauche du sternum et environ 7 mm au-dessus de la marge sous-costale.
Exciser les tissus mous recouvrant les côtes. Élevez les sixième et septième côtes à l’aide d’une pince. Utilisez une seule lame des ciseaux à micro dissection émoussés avec le côté arrondi vers le poumon pour percer soigneusement le muscle intercostal entre les sixième et septième côtes pour entrer dans l’espace intrathoracique.
Délicatement déchargé la cartouche d’air comprimé au niveau du défaut pour faire s’effondrer le poumon et séparer le poumon de la paroi thoracique. Tirez l’air comprimé en courtes rafales pour prévenir les lésions pulmonaires iatrogènes. Placez le poinçon de biopsie sur l’outil de coupe et manœuvrez soigneusement la base de l’outil de coupe à travers l’incision intercostale.
Orientez la base de l’outil de coupe parallèlement à la paroi thoracique et percez un trou circulaire de 5 mm à travers la cage thoracique. À l’aide d’une suture en soie 5-O, placez un point de cordon de la bourse, à environ 1 mm du trou, de manière circonférentielle. Ensuite, positionnez le cadre de la fenêtre dans la paroi thoracique avec les bords du défaut circulaire capturés dans la rainure de la fenêtre.
Attachez fermement la suture de soie 5-O pour verrouiller solidement la fenêtre implantée. Appliquez un flux régulier et doux d’air comprimé pendant environ 10 à 20 secondes pour sécher le poumon. Utilisez la pince pour saisir le cadre de la fenêtre par son bord extérieur et soulevez-la doucement pour assurer la séparation du poumon de la sous-surface du cadre de la fenêtre.
Distribuer une fine couche d’adhésif cyanoacrylate le long de la sous-surface du cadre de la fenêtre optique. Appuyez doucement mais fermement sur le cadre optique de la fenêtre sur le tissu pulmonaire pendant 10 à 20 secondes pour la fixation. Distribuer une goutte d’adhésif de 5 mm sur un couvercle rectangulaire.
Utilisez l’outil de ramassage sous vide pour ramasser un couvercle de 5 mm. Trempez le slip sous-surface du couvercle dans l’adhésif, puis grattez l’excès d’adhésif trois fois contre le côté du couvercle rectangulaire pour faire glisser une très fine couche d’adhésif sur le couvercle. Positionnez délicatement le couvercle à un angle à l’intérieur de l’évidement au centre du cadre de la fenêtre optique, juste au-dessus du tissu pulmonaire.
Serrez brièvement le ventilateur pour générer une pression positive, hyper gonflant le poumon. Orientez le glissement de couverture parallèlement au tissu pulmonaire, en utilisant le mouvement de rotation pour créer un dépôt direct entre la surface du poumon et la sous-surface du glissement de couverture. Maintenez une légère pression pendant environ 25 secondes pour régler l’adhésif cyanoacrylate.
Séparez le couvercle de l’outil de ramassage sous vide à l’aide d’une pince. Créez un point de cordon de la bourse, circonférentiellement, à moins de 1 mm du bord coupé de l’incision cutanée à l’aide d’une suture de soie 5-O. Placez tout excès de peau sous le bord extérieur du cadre de la fenêtre avant d’attacher fermement la fenêtre avec des nœuds de verrouillage.
Distribuez une petite quantité d’adhésif à l’interface en verre métallique pour assurer une étanchéité à l’air entre le couvercle et le cadre de la fenêtre. Fixez l’aiguille stérile à une seringue à insuline de 1 ml. Insérez l’aiguille sous le processus xiphoïde, en avançant vers l’épaule gauche, en entrant dans la cavité thoracique par le diaphragme.
Retirez doucement la seringue pour éliminer tout air résiduel de la cavité thoracique. L’imagerie intravitale multiphotonique d’une seule région pulmonaire a montré que le microvasculaire pouvait être déplacé pendant trois jours consécutifs. Le point de branchement définissable d’un seul navire a été identifié chaque jour consécutif.
Les érythrocytes non marqués ont créé des ombres lorsqu’ils s’écoulent dans des vaisseaux plus gros. L’angle des points de branche par rapport au vaisseau peut être utilisé pour calculer les débits érythrocytaires. La vitesse des érythrocytes a également été quantifiée en injectant à la souris des microsphères fluorescentes et leurs longueurs de piste ont été mesurées divisées par le temps d’acquisition de la trame.
Les microsphères stationnaires et fluides étaient reconnaissables. Le sort des cellules tumorales disséminées a été suivi avec l’imagerie en série sur plusieurs jours, en utilisant la fenêtre pour l’imagerie à haute résolution du poumon. La cellule tumorale est arrivée et s’est logée dans le système vasculaire pulmonaire le premier jour.
Cependant, la cellule n’a pas été détectée dans le système vasculaire pulmonaire les deuxième et troisième jours, ce qui indique une recirculation ou une extravasation. Les étapes culminantes de la progression métastatique dans le poumon ont été visualisées en commençant par l’arrivée des cellules tumorales, l’extravasation des cellules tumorales dans le parenchyme pulmonaire et la prolifération pour former des macro métastases. Prenez soin d’éviter tout traumatisme au poumon lors de la mise en place d’un cadre de fenêtre optique.
Le poumon est sujet aux saignements, ce qui entravera plus tard l’adhérence du glissement de couverture pendant la mise en place. D’autres méthodes qui peuvent être effectuées à la suite de cette procédure comprennent la microscopie intravitale, qui, lorsqu’elle est utilisée avec une approche modifiée de la microcartographie, permet une relocalisation précise des zones d’intérêt pour l’imagerie répétée. Ce protocole a permis la visualisation du poumon dans l’investigation d’une question clé sur le mécanisme des métastases.
Cette étude a le potentiel de reconstruire un nouveau traitement pour les patients atteints de cancer.
